光學(xué)純的手性扁桃酸及其衍生物是有機化學(xué)和藥物化學(xué)中常用的手性拆分劑及醫(yī)藥中間體，應(yīng)用廣泛。現(xiàn)有的扁桃酸手性合成策略依賴過渡金屬催化的不對稱氫化或是有毒試劑氰化物的使用，存在反應(yīng)條件苛刻、試劑昂貴和對環(huán)境不友好等缺陷。因此，開發(fā)綠色、高效、無氰化物的扁桃酸不對稱合成技術(shù)具有重要意義。

　　針對上述問題，中國科學(xué)院上海藥物研究所廖蒼松團隊與鄭明月團隊合作，設(shè)計并構(gòu)建了一種基于C₁延長策略的三酶級聯(lián)反應(yīng)和工程大腸桿菌，以苯甲醛類化合物和甘氨酸為原料，高效不對稱合成扁桃酸類化合物。相關(guān)成果以“Asymmetric C₁ Extension of Aldehydes through Biocatalytic Cascades for Stereodivergent Synthesis of Mandelic Acids”為題于2023年3月16日在線發(fā)表于Angew Chem Int Ed。

圖一：三酶級聯(lián)催化不對稱扁桃酸合成

　　在本研究中，研究人員通過逆生物合成分析，設(shè)計了包含_L-苯絲氨酸醛縮酶(LTA)、_L-苯絲氨酸脫氨酶(LTD)和4-羥基扁桃酸合成酶(HmaS)的三酶級聯(lián)反應(yīng)，并通過文獻和數(shù)據(jù)庫挖掘，對上述酶進行了篩選，組合優(yōu)化在體外構(gòu)建了三酶級聯(lián)反應(yīng)。研究人員首次發(fā)現(xiàn)了HmaS催化活性口袋中關(guān)鍵氨基酸殘基的突變體AoHmaS_S201V相較于AoHmaS_wt顯示出對映選擇性完全反轉(zhuǎn)的結(jié)果，通過分子對接和分子動力學(xué)模擬實驗，初步闡釋了對映選擇性翻轉(zhuǎn)的可能酶分子機制。研究人員利用對映選擇性反轉(zhuǎn)的突變體，同時成功實現(xiàn)了S-和R-型扁桃酸類化合物的高效合成。

　　研究人員基于級聯(lián)反應(yīng)構(gòu)建了工程菌株E.coli (PpLTA-RpLTD-AoHma_Swt) 和E.coli (PpLTA-RpLTD-AoHmaSS201V)作為全細胞催化劑，并優(yōu)化了轉(zhuǎn)化條件。全細胞反應(yīng)優(yōu)化過程中，團隊利用芳香族氨基酸轉(zhuǎn)氨酶敲除的大腸桿菌中作為底盤細胞，避免了扁桃酸合成過程中的競爭反應(yīng)，提高了目標產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化率。最終，團隊利用工程菌株催化合成15個S構(gòu)型的扁桃酸類化合物（圖二）及25個R構(gòu)型的扁桃酸類化合物（圖三），該方法顯示了高收率及高立體選擇性，最高產(chǎn)率>99%，最高ee值>99%。同時研究人員也成功實現(xiàn)了抗血栓藥物氯吡格雷重要藥物中間體(R)-鄰氯扁桃酸的克級規(guī)模制備，產(chǎn)率為81%，ee值為98%。

圖二：三酶級聯(lián)催化(S)-扁桃酸合成

圖三：三酶級聯(lián)催化(R)-扁桃酸合成

　　通過本項研究，合作團隊開發(fā)了高效的生物催化級聯(lián)反應(yīng)和工程菌，從易得原料苯甲醛及甘氨酸出發(fā)，以高產(chǎn)率和高對映選擇性獲得各種手性扁桃酸衍生物，該方法無需額外添加輔助因子，為扁桃酸類化合物的不對稱合成提供了無氰化物的綠色生物合成新技術(shù)。

　　上海藥物所廖蒼松研究員、鄭明月研究員以及廖蒼松團隊毛迎樂助理研究員為論文共同通訊作者，上海藥物所-南京中醫(yī)藥大學(xué)聯(lián)合培養(yǎng)研究生劉燕瓊、上海藥物所博士后付尊蘊以及研究助理董海鴻為論文第一作者。該論文得到國家自然科學(xué)基金、上海市自然科學(xué)基金、臨港實驗室等項目的資助。

　　全文鏈接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/anie.202300906