光學純的手性扁桃酸及其衍生物是有機化學和藥物化學中常用的手性拆分劑及醫藥中間體，應用廣泛。現有的扁桃酸手性合成策略依賴過渡金屬催化的不對稱氫化或是有毒試劑氰化物的使用，存在反應條件苛刻、試劑昂貴和對環境不友好等缺陷。因此，開發綠色、高效、無氰化物的扁桃酸不對稱合成技術具有重要意義。

　　針對上述問題，中國科學院上海藥物研究所廖蒼松團隊與鄭明月團隊合作，設計并構建了一種基于C₁延長策略的三酶級聯反應和工程大腸桿菌，以苯甲醛類化合物和甘氨酸為原料，高效不對稱合成扁桃酸類化合物。相關成果以“Asymmetric C₁ Extension of Aldehydes through Biocatalytic Cascades for Stereodivergent Synthesis of Mandelic Acids”為題于2023年3月16日在線發表于Angew Chem Int Ed。

圖一：三酶級聯催化不對稱扁桃酸合成

　　在本研究中，研究人員通過逆生物合成分析，設計了包含_L-苯絲氨酸醛縮酶(LTA)、_L-苯絲氨酸脫氨酶(LTD)和4-羥基扁桃酸合成酶(HmaS)的三酶級聯反應，并通過文獻和數據庫挖掘，對上述酶進行了篩選，組合優化在體外構建了三酶級聯反應。研究人員首次發現了HmaS催化活性口袋中關鍵氨基酸殘基的突變體AoHmaS_S201V相較于AoHmaS_wt顯示出對映選擇性完全反轉的結果，通過分子對接和分子動力學模擬實驗，初步闡釋了對映選擇性翻轉的可能酶分子機制。研究人員利用對映選擇性反轉的突變體，同時成功實現了S-和R-型扁桃酸類化合物的高效合成。

　　研究人員基于級聯反應構建了工程菌株E.coli (PpLTA-RpLTD-AoHma_Swt) 和E.coli (PpLTA-RpLTD-AoHmaSS201V)作為全細胞催化劑，并優化了轉化條件。全細胞反應優化過程中，團隊利用芳香族氨基酸轉氨酶敲除的大腸桿菌中作為底盤細胞，避免了扁桃酸合成過程中的競爭反應，提高了目標產物的轉化率。最終，團隊利用工程菌株催化合成15個S構型的扁桃酸類化合物（圖二）及25個R構型的扁桃酸類化合物（圖三），該方法顯示了高收率及高立體選擇性，最高產率>99%，最高ee值>99%。同時研究人員也成功實現了抗血栓藥物氯吡格雷重要藥物中間體(R)-鄰氯扁桃酸的克級規模制備，產率為81%，ee值為98%。

圖二：三酶級聯催化(S)-扁桃酸合成

圖三：三酶級聯催化(R)-扁桃酸合成

　　通過本項研究，合作團隊開發了高效的生物催化級聯反應和工程菌，從易得原料苯甲醛及甘氨酸出發，以高產率和高對映選擇性獲得各種手性扁桃酸衍生物，該方法無需額外添加輔助因子，為扁桃酸類化合物的不對稱合成提供了無氰化物的綠色生物合成新技術。

　　上海藥物所廖蒼松研究員、鄭明月研究員以及廖蒼松團隊毛迎樂助理研究員為論文共同通訊作者，上海藥物所-南京中醫藥大學聯合培養研究生劉燕瓊、上海藥物所博士后付尊蘊以及研究助理董海鴻為論文第一作者。該論文得到國家自然科學基金、上海市自然科學基金、臨港實驗室等項目的資助。

　　全文鏈接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/anie.202300906