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導(dǎo)讀

近日，哈佛醫(yī)學(xué)院Brian J. Bacskai和Hak Soo Choi教授團(tuán)隊(duì)在利用近紅外熒光壽命技術(shù)穿透小鼠完整頭骨實(shí)現(xiàn)對(duì)淀粉樣β-蛋白聚集物和tau原纖維的成像方面取得新進(jìn)展，相關(guān)研究成果以“Near-infrared fluorescence lifetime imaging of amyloid-β aggregates and tau fibrils through the intact skull of mice”為題發(fā)表在Nature Biomedical Engineering（影響因子：29.234）上。本文報(bào)道了近紅外離子型七次甲基熒光染料ZW800-1C在與淀粉樣β-蛋白聚集物和tau原纖維結(jié)合后表現(xiàn)出高對(duì)比度，并實(shí)現(xiàn)了穿過小鼠完整頭骨的顯微成像。在阿爾茨海默病的轉(zhuǎn)基因小鼠模型中，作者將ZW800-1C與兩種光譜性質(zhì)類似的熒光團(tuán)ZW800-1A和吲哚菁綠（ICG）的性能進(jìn)行比較，數(shù)據(jù)表明ZW800-1C染料在與蛋白聚集物和原纖維結(jié)合后展現(xiàn)出了更明顯的熒光壽命差異，有望應(yīng)用于對(duì)嚙齒動(dòng)物中淀粉樣β-蛋白聚集物和tau原纖維的檢測。文章鏈接DOI: 10.1038/s41551-023-01003-7。

正文

阿爾茨海默病(AD)是一種致命的神經(jīng)退行性疾病，該疾病的主要神經(jīng)病理學(xué)特征是由淀粉樣β-蛋白和神經(jīng)原纖維纏結(jié)（NFTs）聚集而形成的細(xì)胞外病變老年斑。目前，AD病理成像的最常見手段是磁共振成像（MRI），正電子發(fā)射斷層掃描（PET），單光子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層掃描 (SPECT)和光學(xué)成像技術(shù)。其中，光學(xué)成像技術(shù)具有高靈敏度、相對(duì)安全、成本低和操作性強(qiáng)的特點(diǎn)。相對(duì)于可見光窗口而言，血液和皮膚組織對(duì)近紅外窗口（700-1000 nm）的激發(fā)和發(fā)射光的吸收與散射作用較小。因此，使用發(fā)光波長靠近近紅外波段的材料能夠有效減少背景熒光的干擾，增加組織的穿透深度，提高成像分辨率。但是目前近紅外發(fā)射的AD探針卻鮮有報(bào)道。下載化學(xué)加APP到你手機(jī)桌面，更方便更多收獲。

本文中，作者將近紅外七次甲基熒光染料ZW800-1C用于體內(nèi)AD成像。數(shù)據(jù)表明該染料具有穿透模型小鼠血腦屏障（BBB）的能力。作者還將其與性質(zhì)相似的染料ZW800-1A和吲哚菁綠（ICG）進(jìn)行了性能對(duì)比。長波激發(fā)/長波發(fā)射的近紅外染料ZW800-1C可以穿透小鼠的完整頭骨對(duì)淀粉樣斑塊、腦淀粉樣血管病變（CAA）和NFTs進(jìn)行無創(chuàng)成像。此外，該染料還展現(xiàn)出可作為熒光壽命探針檢測AD的潛力。如Fig.1a所示，ZW800-1A具有中心為氧原子的“柔性”連接基團(tuán)。ZW800-1C中相對(duì)疏水的C-C鍵使其具有更好的雙親性。作者還將其與近紅外染ZW800-1A和ICG進(jìn)行了光譜對(duì)比（Fig.1b），均處于近紅外發(fā)射區(qū)。

Fig. 1 七甲川染料用于AD成像（圖片來源：Nat. Biomed. Eng.）

作者還利用寬場顯微鏡對(duì)三種染料分別染色的APP/PS1 和 rTg4510模型小鼠的腦組織切片進(jìn)行了成像（Fig.2）。圖像表明ZW800-1C、ICG與ThioS（AD的商用靶向探針）的共定位系數(shù)較高，而ZW800-1A對(duì)APP/PS1型小鼠中的淀粉樣β-蛋白聚集物則沒有明顯的特異性識(shí)別。在rTg4510模型小鼠中，ZW800-1C與ICG對(duì)NFTs的共定位效果較好。對(duì)比之下，ZW800-1A和ICG只表現(xiàn)了單一的背景信號(hào)。

Fig. 2 APP/PS1和rTg4510型小鼠腦切片中淀粉樣斑塊的體外圖像（圖片來源：Nat. Biomed. Eng.）

為了同時(shí)進(jìn)行可見光和近紅外區(qū)體內(nèi)成像，作者搭建了多模式顯微鏡并考察了三種染料對(duì)APP/PS1模型小鼠的BBB穿透能力以及對(duì)淀粉樣斑塊和CAA的標(biāo)記能力（Fig.3a）。在對(duì)小鼠進(jìn)行成像前1h，作者對(duì)其注射了甲氧基-X04（MX04）以標(biāo)記淀粉樣斑塊和CAA。接下來，作者利用雙光子顯微鏡考察在770 nm的激發(fā)光下ZW800-1C、ICG和ZW800-1A對(duì)CAA（Fig.3b）和斑塊（Fig.3c）的標(biāo)記效果。為了定量估計(jì)探針的標(biāo)記強(qiáng)度，作者還計(jì)算了熒光團(tuán)對(duì)斑塊和CAA的平均強(qiáng)度（Fig.3d）以及大腦（Fig.3e）和尾靜脈間歇采血測得的血液中近紅外熒光團(tuán)的動(dòng)力學(xué)代謝過程。圖Fig.3f表明在注射12 h后，三種染料的代謝率相似，強(qiáng)度均下降至最大值的20%。

Fig. 3 ICG、ZW800-1A和ZW800-1C染料對(duì)APP/PS1型小鼠的體內(nèi)成像（圖片來源：Nat. Biomed. Eng.）

作者又展開了三種染料對(duì)活體中NFT標(biāo)記成像能力的考察（Fig.4a）。為了確認(rèn)探針對(duì)NFT是否靶向，小鼠體內(nèi)被提前注射了商用綠光染料HS-84。通過將三種染料與HS-84的共定位效果進(jìn)行對(duì)比發(fā)現(xiàn)，ZW800-1C與HS-84的共定位效果較好，說明該染料能有NFT進(jìn)行特異性結(jié)合（Fig.4d）。對(duì)比之下，ICG和ZW800-1A無法對(duì)細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記（Fig.4b, c）。此外，ZW800-1C在與NFTs結(jié)合后標(biāo)記強(qiáng)度在前12 h內(nèi)迅速下降，注射后24小時(shí)強(qiáng)度可以忽略不計(jì)（Fig.4e）。

Fig.4 ICG、ZW800-1A和ZW800-1C染料對(duì)rTg4510型小鼠的體內(nèi)成像（圖片來源：Nat. Biomed. Eng.）

作者利用熒光壽命成像顯微鏡（FLIM）技術(shù)探究ZW800-1C在與AD樣品結(jié)合后是否伴隨著熒光壽命的變化。將ZW800-1C分別注入C57BL/6J, APP/PS1和 rTg4510型小鼠體內(nèi)，得到的熒光壽命圖像如圖Fig.5a-e所示。在C57BL/6J型小鼠中，ZW800-1C在血管中測得的平均壽命為測量值為0.84 ns（Fig.5a）。在APP/PS1型小鼠中觀察到ZW800-1C在與CAA結(jié)合后，熒光壽命相對(duì)于血管中有所增加（Fig.5b）。在注射后2 h，染料與CAA（Fig.5c）和斑塊（Fig.5d）結(jié)合后的熒光壽命均相比于在血管中的要更長。同時(shí)，在rTg4510型小鼠中也可以觀察到ZW800-1C與NFT結(jié)合后壽命增加，平均壽命為1.14 ns （Fig.5e）。Fig.5f則給出了探針在血管中，β-淀粉樣蛋白和tau聚集物中的平均熒光衰減壽命。通過比較ZW800-1C在血管內(nèi)的壽命分布、與β-淀粉樣蛋白和tau聚集物結(jié)合后的壽命，發(fā)現(xiàn)三組樣本存在明顯差別（Fig.5g）。因此，利用ZW800-1C在血管中、與AD樣品結(jié)合后熒光壽命的差異可進(jìn)行標(biāo)記成像。

Fig.5 ZW800-1C染料對(duì)C57BL/6J, APP/PS1和 rTg4510 micerTg4510型小鼠的體內(nèi)成像（圖片來源：Nat. Biomed. Eng.）

最后，為了提高深層組織的成像分辨率，作者進(jìn)行了雙光子成像實(shí)驗(yàn)的探索。作者測試得到ZW800-1C的最大峰值吸收在1300 nm（Fig.6a）。借助雙光子顯微鏡觀察到ZW800-1C可以穿透小鼠的血腦屏障（Fig.6b），探針在小鼠腦中被代謝的速率較慢（Fig.6c）。為了進(jìn)一步表征ZW800-1C的體內(nèi)成像能力，作者對(duì)比了探針在體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)的成像信噪比（Fig.6d,e），同時(shí)證明該探針可以能夠穿透完整顱骨進(jìn)行AD樣品的無損成像（Fig.6f-h），并能達(dá)到對(duì)單個(gè)NFT的高分辨率標(biāo)記（Fig.6i）。此外，與通過顱窗的測量相比（Fig.6j），探針在穿過完整顱骨成像時(shí)的平均熒光壽命變短（對(duì)于淀粉樣斑塊，顱窗為1.24 ns，完整顱骨為1.05 ns；對(duì)于NFTs，顱窗為1.14 ns，完整顱骨為0.85 ns)。

Fig.6 ZW800-1C染料對(duì)AD樣品的雙光子和無損熒光壽命成像（圖片來源：Nat. Biomed. Eng.）

總結(jié)

哈佛醫(yī)學(xué)院Brian J. Bacskai和Hak Soo Choi教授團(tuán)隊(duì)報(bào)道了一種AD探針ZW800-1C。該探針在753 nm的激發(fā)光下可發(fā)射出772 nm的長波發(fā)射，因而被用于對(duì)β-蛋白聚集物和tau原纖維的近紅外成像。相比于ZW800-1A和ICG染料，該探針在對(duì)AD模型小鼠的體內(nèi)成像中取得了更好的檢測效果。此外，作者利用FLIM技術(shù)發(fā)現(xiàn)ZW800-1C染料在與蛋白聚集物和原纖維結(jié)合后展現(xiàn)出了更明顯的熒光壽命差異，對(duì)于區(qū)分AD病理和非特異性背景信號(hào)的意義重大。

文獻(xiàn)詳情：

Steven S. Hou, Joyce Yang, Jeong Heon Lee, Yeseo Kwon, Maria Calvo-Rodriguez, Kai Bao, Sung Ahn, Satoshi Kashiwagi, Anand T. N. Kumar, Brian J. Bacskai*, Hak Soo Choi*. Near-infrared fluorescence lifetime imaging of amyloid-β aggregates and tau fibrils through the intact skull of mice.

2023, https://doi.org/10.1038/s41551-023-01003-7