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導讀

近日，哈佛醫(yī)學院Brian J. Bacskai和Hak Soo Choi教授團隊在利用近紅外熒光壽命技術(shù)穿透小鼠完整頭骨實現(xiàn)對淀粉樣β-蛋白聚集物和tau原纖維的成像方面取得新進展，相關(guān)研究成果以“Near-infrared fluorescence lifetime imaging of amyloid-β aggregates and tau fibrils through the intact skull of mice”為題發(fā)表在Nature Biomedical Engineering（影響因子：29.234）上。本文報道了近紅外離子型七次甲基熒光染料ZW800-1C在與淀粉樣β-蛋白聚集物和tau原纖維結(jié)合后表現(xiàn)出高對比度，并實現(xiàn)了穿過小鼠完整頭骨的顯微成像。在阿爾茨海默病的轉(zhuǎn)基因小鼠模型中，作者將ZW800-1C與兩種光譜性質(zhì)類似的熒光團ZW800-1A和吲哚菁綠（ICG）的性能進行比較，數(shù)據(jù)表明ZW800-1C染料在與蛋白聚集物和原纖維結(jié)合后展現(xiàn)出了更明顯的熒光壽命差異，有望應用于對嚙齒動物中淀粉樣β-蛋白聚集物和tau原纖維的檢測。文章鏈接DOI: 10.1038/s41551-023-01003-7。

正文

阿爾茨海默病(AD)是一種致命的神經(jīng)退行性疾病，該疾病的主要神經(jīng)病理學特征是由淀粉樣β-蛋白和神經(jīng)原纖維纏結(jié)（NFTs）聚集而形成的細胞外病變老年斑。目前，AD病理成像的最常見手段是磁共振成像（MRI），正電子發(fā)射斷層掃描（PET），單光子發(fā)射計算機斷層掃描 (SPECT)和光學成像技術(shù)。其中，光學成像技術(shù)具有高靈敏度、相對安全、成本低和操作性強的特點。相對于可見光窗口而言，血液和皮膚組織對近紅外窗口（700-1000 nm）的激發(fā)和發(fā)射光的吸收與散射作用較小。因此，使用發(fā)光波長靠近近紅外波段的材料能夠有效減少背景熒光的干擾，增加組織的穿透深度，提高成像分辨率。但是目前近紅外發(fā)射的AD探針卻鮮有報道。下載化學加APP到你手機桌面，更方便更多收獲。

本文中，作者將近紅外七次甲基熒光染料ZW800-1C用于體內(nèi)AD成像。數(shù)據(jù)表明該染料具有穿透模型小鼠血腦屏障（BBB）的能力。作者還將其與性質(zhì)相似的染料ZW800-1A和吲哚菁綠（ICG）進行了性能對比。長波激發(fā)/長波發(fā)射的近紅外染料ZW800-1C可以穿透小鼠的完整頭骨對淀粉樣斑塊、腦淀粉樣血管病變（CAA）和NFTs進行無創(chuàng)成像。此外，該染料還展現(xiàn)出可作為熒光壽命探針檢測AD的潛力。如Fig.1a所示，ZW800-1A具有中心為氧原子的“柔性”連接基團。ZW800-1C中相對疏水的C-C鍵使其具有更好的雙親性。作者還將其與近紅外染ZW800-1A和ICG進行了光譜對比（Fig.1b），均處于近紅外發(fā)射區(qū)。

Fig. 1 七甲川染料用于AD成像（圖片來源：Nat. Biomed. Eng.）

作者還利用寬場顯微鏡對三種染料分別染色的APP/PS1 和 rTg4510模型小鼠的腦組織切片進行了成像（Fig.2）。圖像表明ZW800-1C、ICG與ThioS（AD的商用靶向探針）的共定位系數(shù)較高，而ZW800-1A對APP/PS1型小鼠中的淀粉樣β-蛋白聚集物則沒有明顯的特異性識別。在rTg4510模型小鼠中，ZW800-1C與ICG對NFTs的共定位效果較好。對比之下，ZW800-1A和ICG只表現(xiàn)了單一的背景信號。

Fig. 2 APP/PS1和rTg4510型小鼠腦切片中淀粉樣斑塊的體外圖像（圖片來源：Nat. Biomed. Eng.）

為了同時進行可見光和近紅外區(qū)體內(nèi)成像，作者搭建了多模式顯微鏡并考察了三種染料對APP/PS1模型小鼠的BBB穿透能力以及對淀粉樣斑塊和CAA的標記能力（Fig.3a）。在對小鼠進行成像前1h，作者對其注射了甲氧基-X04（MX04）以標記淀粉樣斑塊和CAA。接下來，作者利用雙光子顯微鏡考察在770 nm的激發(fā)光下ZW800-1C、ICG和ZW800-1A對CAA（Fig.3b）和斑塊（Fig.3c）的標記效果。為了定量估計探針的標記強度，作者還計算了熒光團對斑塊和CAA的平均強度（Fig.3d）以及大腦（Fig.3e）和尾靜脈間歇采血測得的血液中近紅外熒光團的動力學代謝過程。圖Fig.3f表明在注射12 h后，三種染料的代謝率相似，強度均下降至最大值的20%。

Fig. 3 ICG、ZW800-1A和ZW800-1C染料對APP/PS1型小鼠的體內(nèi)成像（圖片來源：Nat. Biomed. Eng.）

作者又展開了三種染料對活體中NFT標記成像能力的考察（Fig.4a）。為了確認探針對NFT是否靶向，小鼠體內(nèi)被提前注射了商用綠光染料HS-84。通過將三種染料與HS-84的共定位效果進行對比發(fā)現(xiàn)，ZW800-1C與HS-84的共定位效果較好，說明該染料能有NFT進行特異性結(jié)合（Fig.4d）。對比之下，ICG和ZW800-1A無法對細胞進行標記（Fig.4b, c）。此外，ZW800-1C在與NFTs結(jié)合后標記強度在前12 h內(nèi)迅速下降，注射后24小時強度可以忽略不計（Fig.4e）。

Fig.4 ICG、ZW800-1A和ZW800-1C染料對rTg4510型小鼠的體內(nèi)成像（圖片來源：Nat. Biomed. Eng.）

作者利用熒光壽命成像顯微鏡（FLIM）技術(shù)探究ZW800-1C在與AD樣品結(jié)合后是否伴隨著熒光壽命的變化。將ZW800-1C分別注入C57BL/6J, APP/PS1和 rTg4510型小鼠體內(nèi)，得到的熒光壽命圖像如圖Fig.5a-e所示。在C57BL/6J型小鼠中，ZW800-1C在血管中測得的平均壽命為測量值為0.84 ns（Fig.5a）。在APP/PS1型小鼠中觀察到ZW800-1C在與CAA結(jié)合后，熒光壽命相對于血管中有所增加（Fig.5b）。在注射后2 h，染料與CAA（Fig.5c）和斑塊（Fig.5d）結(jié)合后的熒光壽命均相比于在血管中的要更長。同時，在rTg4510型小鼠中也可以觀察到ZW800-1C與NFT結(jié)合后壽命增加，平均壽命為1.14 ns （Fig.5e）。Fig.5f則給出了探針在血管中，β-淀粉樣蛋白和tau聚集物中的平均熒光衰減壽命。通過比較ZW800-1C在血管內(nèi)的壽命分布、與β-淀粉樣蛋白和tau聚集物結(jié)合后的壽命，發(fā)現(xiàn)三組樣本存在明顯差別（Fig.5g）。因此，利用ZW800-1C在血管中、與AD樣品結(jié)合后熒光壽命的差異可進行標記成像。

Fig.5 ZW800-1C染料對C57BL/6J, APP/PS1和 rTg4510 micerTg4510型小鼠的體內(nèi)成像（圖片來源：Nat. Biomed. Eng.）

最后，為了提高深層組織的成像分辨率，作者進行了雙光子成像實驗的探索。作者測試得到ZW800-1C的最大峰值吸收在1300 nm（Fig.6a）。借助雙光子顯微鏡觀察到ZW800-1C可以穿透小鼠的血腦屏障（Fig.6b），探針在小鼠腦中被代謝的速率較慢（Fig.6c）。為了進一步表征ZW800-1C的體內(nèi)成像能力，作者對比了探針在體內(nèi)和體外實驗的成像信噪比（Fig.6d,e），同時證明該探針可以能夠穿透完整顱骨進行AD樣品的無損成像（Fig.6f-h），并能達到對單個NFT的高分辨率標記（Fig.6i）。此外，與通過顱窗的測量相比（Fig.6j），探針在穿過完整顱骨成像時的平均熒光壽命變短（對于淀粉樣斑塊，顱窗為1.24 ns，完整顱骨為1.05 ns；對于NFTs，顱窗為1.14 ns，完整顱骨為0.85 ns)。

Fig.6 ZW800-1C染料對AD樣品的雙光子和無損熒光壽命成像（圖片來源：Nat. Biomed. Eng.）

總結(jié)

哈佛醫(yī)學院Brian J. Bacskai和Hak Soo Choi教授團隊報道了一種AD探針ZW800-1C。該探針在753 nm的激發(fā)光下可發(fā)射出772 nm的長波發(fā)射，因而被用于對β-蛋白聚集物和tau原纖維的近紅外成像。相比于ZW800-1A和ICG染料，該探針在對AD模型小鼠的體內(nèi)成像中取得了更好的檢測效果。此外，作者利用FLIM技術(shù)發(fā)現(xiàn)ZW800-1C染料在與蛋白聚集物和原纖維結(jié)合后展現(xiàn)出了更明顯的熒光壽命差異，對于區(qū)分AD病理和非特異性背景信號的意義重大。

文獻詳情：

Steven S. Hou, Joyce Yang, Jeong Heon Lee, Yeseo Kwon, Maria Calvo-Rodriguez, Kai Bao, Sung Ahn, Satoshi Kashiwagi, Anand T. N. Kumar, Brian J. Bacskai*, Hak Soo Choi*. Near-infrared fluorescence lifetime imaging of amyloid-β aggregates and tau fibrils through the intact skull of mice.

2023, https://doi.org/10.1038/s41551-023-01003-7