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JACS：精氨酸ADP-核糖基化：翻譯后修飾泛素蛋白的化學合成

來源：化學加原創(chuàng)      2022-11-20
導讀：近日，荷蘭萊頓大學醫(yī)學中心Dmitri V. Filippov和Gerbrand J. van der Heden van Noort團隊在JACS上發(fā)表了題為“Arginine ADP-Ribosylation: Chemical Synthesis of Post-Translationally Modified Ubiquitin Proteins”的文章，開發(fā)和優(yōu)化了用腺苷-二磷酸-核糖基（ADPr）基團制備在精氨酸殘基上修飾的肽和蛋白質(zhì)的方法。該方法包括將含有多肽的鳥氨酸與α-連接的異硫脲N-核糖苷反應(yīng)，隨后在核糖基部分的5′-羥基處安裝磷酸單酯，然后轉(zhuǎn)化為二磷酸腺苷。作者使用這種方法獲得四種ADP-核糖基化泛素（UbADPr）的區(qū)域異構(gòu)體，實現(xiàn)了在泛素（Ub）蛋白內(nèi)不同精氨酸位置上的ADP-核糖基殘基修飾，是作為完全合成精氨酸連接ADPr修飾蛋白的首例報道。
細胞內(nèi)蛋白質(zhì)的翻譯后修飾（PTM）會影響蛋白質(zhì)的功能、定位和廣泛的細胞信號傳導過程。PTM包括相對較小的基團，如磷酸鹽或甲基，但也可能涉及更復雜的分子實體，如（多）糖苷和ADP-核糖（ADPr）部分，甚至整個蛋白質(zhì)，如泛素（Ub）。在ADPr的情況下，單ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶（mARTs）通過靶蛋白中的親核氨基酸側(cè)鏈催化煙酰胺從β-NAD中置換，從而通過α-構(gòu)型的核糖鍵有效地將ADP-核糖連接到蛋白質(zhì)。與大多數(shù)PTM一樣，ADP-核糖基化是一個高度動態(tài)的過程，特異性寫入器（mART）和橡皮擦（ADPr-水解酶（ARH））酶可以作用于特定的蛋白質(zhì)或氨基酸。精氨酸殘基的δ-胍基團的ADP-核糖基化通常由ART-C亞家族催化。軍團菌使用SidE蛋白（SdeA、SdeB、SdeC和SidE）劫持真核宿主細胞的泛素途徑，并以非常規(guī)的方式泛素化宿主細胞蛋白。這種多步驟級聯(lián)從軍團菌SidE mART結(jié)構(gòu)域開始。隨后，SidE中的磷酸二酯酶（PDE）結(jié)構(gòu)域催化宿主細胞底物蛋白的絲氨酸與精氨酸連接的Ub之間形成磷酸二酯鍵ADPr同時排出一磷酸腺苷（Fig. 1B）。通過這種方式，細菌效應(yīng)酶通過精氨酸-磷酸核糖鍵有效地將宿主Ub連接到宿主底物蛋白。

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Fig. 1: （A）本研究提出的進展和（B）嗜肺乳桿菌酶用于（去）泛素化宿主細胞底物蛋白的途徑的示意。（圖片來源：J. Am. Chem. Soc.）
作者團隊和其他人之前已經(jīng)報道了ADP-核糖基化肽的合成，其中ADP-核糖連接到Ser、Thr或Cys、和Asn、Gln以及非天然氨基酸（Fig. 1A）。本文中，作者開發(fā)了一種普遍適用于在精氨酸上合成ADP核糖基化肽的方法，并將這種策略擴展到天然連接的ADP-核糖基化蛋白UbADPr的全化學合成。首先，作者進行了異硫脲核糖苷的合成。該化合物的合成始于5-O-((tert-butyl)-diphenylsilyl)-β-d-ribofuranosyl azide 2（Scheme 1A）。經(jīng)過嘗試，在硅藻土墊上過濾除去催化劑后，無需進一步處理或純化所得濾液即連接異硫氰酸酯。最后，分別以64%和12%的產(chǎn)率獲得核糖基異硫脲1α和1β。
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Scheme 1. 精氨酸連接的ADPr肽的合成方案。（圖片來源：J. Am. Chem. Soc.）
得到核糖基異硫脲1α之后，作者在樹脂上進行了模型七肽14（Ac-GRADPrLIFAG-OH）的合成（B）。肽14來源于人Ub蛋白，含有已知在Arg42殘基上被嗜肺乳桿菌效應(yīng)酶ADP核糖基化的氨基酸。Nδ-Alloc保護的鳥氨酸被摻入肽序列中ADP-核糖基化位點上。經(jīng)過Alloc保護和脫保護，使用AgNO3作為路易斯酸將構(gòu)建單元1α對肽6進行胍基化修飾。LC-MS分析顯示完全轉(zhuǎn)化。接下來，對核糖基部分上的5′-OH進行脫硅烷、對伯醇進行磷化和PIII到PV氧化。對肽11的脫保護制備了用于PV到PIII與以TBS和Boc為保護基團的腺苷酰胺12偶聯(lián)。隨后，用DBU去除焦磷酸部分上的氰乙基保護基團，得到受保護的肽-ADPr 13。最后，在DCM中使用10%三氟乙酸（TFA）從樹脂中裂解肽，經(jīng)RP-HPLC純化分離出肽14（總產(chǎn)率為9.3%），這是首個合成Arg連接的ADPr肽的例子。同時，盡管用于胍基化反應(yīng)的異硫脲核糖是純α-構(gòu)型，作者通過1H NMR觀察到異構(gòu)體的混合物比例為6：4（α / β）。
接下來，作者的合成方法從肽推斷到蛋白質(zhì)。化學合成Arg42UbADPr使用類似于獲得肽14的方案進行，并通過小樹脂樣品的測試裂解進行監(jiān)測。首先，經(jīng)過脫保護暴露鳥氨酸部分的胺，與1α的樹脂上胍基化反應(yīng)順利進行。隨后的磷酸化、氧化和PV–PIII偶聯(lián)產(chǎn)生完全保護的樹脂結(jié)合Arg42UbADPr。作者通過孵育UbADPr證實了這種酸在TFA（90.5%）中1.5小時的穩(wěn)定性（和庚聚體14）。使用這些條件，從樹脂中完全裂解和整體脫保護，然后進行HPLC純化，得到合成的Arg42UbADPr18的總收率為1.8%。通過在SPPS期間將Nδ-Alloc保護的鳥氨酸結(jié)合在蛋白質(zhì)的另一位置，可以直接將ADPr基團引入到Ub中的其它精氨酸殘基。作者成功地在Ub的Arg54、Arg72或Arg74上引入了UbADPr，獲得共軛物19–21，總分離產(chǎn)率分別為1.8%、1.2%和1.7%。
為了研究軍團菌效應(yīng)酶（DUPs）是否能夠水解所合成的ADPr肽中的焦磷酸鹽，作者將Ub衍生的Arg-ADPr七肽14與DupA孵育，并使用1H NMR進行了表征。結(jié)果證實了合成的Arg-ADPr肽被酶的催化活性識別和加工。此外，DupA似乎更喜歡α而不是β，水解α-構(gòu)型的Arg-ADPr肽14（大約1.5 ×）比其β-異構(gòu)體更快。這也與之前的報道相一致。
受到DupA處理合成ADPr肽這一事實的鼓舞，作者接下來著手比較水解速率與酶促產(chǎn)生Arg42UbADPr的水解速率。將合成的ADPr肽在緩沖溶液中在DupA存在下進行孵育，并在指定時間使用高分辨率質(zhì)譜分析（Fig. 2C）。在該水解測定中，酶Arg42UbADPr在30分鐘內(nèi)被DupA完全水解至Arg42UbPr。泛素衍生的庚聚體14和15的速率低于Arg42UbADPr，90分鐘后分別顯示48%和52%的水解。
接下來，作者通過DupA孵育各自的UbADPr類似物，研究了所合成的4個UbADPr蛋白18?21的識別和水解情況，并與酶制備的Arg42UbADPr進行了比較。Arg42UbADPr在沒有DupA的緩沖液中，長時間內(nèi)不會導致水解。合成的Arg42UbADPr18和Arg42衍生的UbADPr庚聚體14幾乎完全加工，酶Arg42UbADPr也是如此。盡管Arg74UbADPr低于Arg42UbADPr，但Arg74UbADPr的水解程度明顯高于Arg54UbADPr和Arg72UbADPr。執(zhí)行類似的測定并分析較早時間點（15-90分鐘）的轉(zhuǎn)換顯示酶Arg42UbADPr15分鐘后完全水解。Arg42UbADPr在這段時間內(nèi)水解不太明顯（30分鐘后為52%）和（90分鐘后為65%）（Fig. 3B），而其它三個UbADPr通過Arg72，Arg74和Arg54連接的DupA水解明顯較少，佐證了DupA對Arg42的偏好。Arg42UbADPr可能是以與酶Arg42UbADPr相當?shù)乃俣忍幚恙?異構(gòu)體。
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Fig.3. DupA介導的UbADPr水解成UbPr。（圖片來源：J. Am. Chem. Soc.）
作者的下一個目標是研究軍團病發(fā)病的關(guān)鍵生物過程SdeA介導的底物ER蛋白與Ub ADPr的連接。作者合成了一種20聚體肽，來源于已知是SidE效應(yīng)子底物的ER重塑RTN4b蛋白（23），在N-末端連接羅丹明熒光團。正如已經(jīng)報道的那樣，SdeA偶連Arg42UbADPr到肽23形成磷酸核糖連接Arg42Ub-RTN4b產(chǎn)物（Fig. 4A）并顯示焦磷酸鍵的部分水解至Arg42UbPr。這證實了肽23是誘導PDE介導的連接Arg42UbADPr的合適底物，并且四種合成泛素18-21也可以參與這一過程。
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Fig.4. SdeA介導的UbADPr連接熒光RTN4b 20-聚體片段23。（圖片來源：J. Am. Chem. Soc.）

總結(jié)

荷蘭萊頓大學醫(yī)學中心Dmitri V. Filippov和Gerbrand J. van der Heden van Noort團隊開發(fā)了在精氨酸連接ADPr肽和蛋白質(zhì)UbADPr的方法，是攜帶天然精氨酸鍵的ADP核糖基化蛋白質(zhì)的首次全化學合成。ADPr肽和ADPr泛素區(qū)域異構(gòu)體在水解和連接測定中能夠被軍團菌效應(yīng)子（DupA和SdeA）識別。在精氨酸殘基上進行定點引入ADPr的能力可以獲得生化方法無法的得到的明確定義材料，并且在水解測定中，軍團菌效應(yīng)子DupA和SdeA有利于Arg42UbADPr聯(lián)動。毫無疑問，該方法為肽和蛋白質(zhì)提供天然ADPr氨基酸連接，用于分析參與安裝和去除ADPr修飾的酶的位點特異性。


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