胍丁胺又名1-（4-氨基丁基）胍，是一種精氨酸經(jīng)精氨酸脫羧酶 (ADC)脫羧作用而衍生的化合物。它具有廣泛的治療應(yīng)用，包括糖尿病、神經(jīng)外傷和神經(jīng)退行性疾病，阿片類藥物成癮，情緒障礙，認(rèn)知疾病和癌癥。胍丁胺結(jié)構(gòu)也存在于多種天然化合物，如 E-642 或以及像 blenoxane 的多肽類藥物，并經(jīng)常用作精氨酸在肽 C 末端替代以探索受體-配體作用。氨基的amidination是最常見的一種合成胍化合物的方法。碳二亞胺、O-甲基異脲、硫脲、異硫脲、 氨基（亞氨基）甲磺酸、氯甲脒、1H-吡唑-1-甲脒，N-三氟甲脒，和氰胺 傳統(tǒng)上被用于將胺轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的受保護(hù)或未受保護(hù)的胍化合物。盡管在合成方面取得了某些應(yīng)用，在工業(yè)中大量生產(chǎn)胍丁胺多肽藥物仍然受到傳統(tǒng)工藝的限制。因?yàn)橄鄳?yīng)的amidination條件通常要求金屬基催化劑、加熱、氧化劑或長反應(yīng)時(shí)間。此外，多肽中親核官能團(tuán)的存在，可能進(jìn)一步限制amidination策略的應(yīng)用。去氨加壓素的類似物多肽FE 201836, 一種作為血管加壓素-2受體激動(dòng)劑和針對夜尿癥的環(huán)狀硫醚肽，在其多肽的 C 端帶有胍丁胺殘基（Scheme 1）。FE 201836 有一個(gè) Thi (噻吩基丙氨酸)殘基和硫醚結(jié)構(gòu)，它們都對親電試劑高度敏感，可以發(fā)生例如氧化和碘化的副反應(yīng)。目標(biāo)胍丁胺部分可以通過1,4-丁二胺前體上氨基的amidination反應(yīng)實(shí)現(xiàn)，但這個(gè)過程可能會(huì)對Thi和硫醚產(chǎn)生副反應(yīng)。鑒于這些限制，一個(gè)使用溫和的合成策略引入胍丁胺成為重點(diǎn)內(nèi)容。Scheme 1. FE 201836化學(xué)結(jié)構(gòu)。胍丁胺硫酸鹽的應(yīng)用，位置異構(gòu)體和二聚雜質(zhì)的形成胍丁胺硫酸鹽（Scheme 2) 是一種市售化合物，對很多疾病具有廣泛的治療潛力。它也經(jīng)常被用作營養(yǎng)補(bǔ)充劑。這種原料可能被用作胍丁胺替代品制備 FE 201836 肽。在 FE 201836 合成過程中，前體線性肽中間體 A 首先在 CTC 樹脂上進(jìn)行固相合成， 然后被 10% (v/v) HFIP（六氟異丙醇）/DCM（二氯甲烷）切割，并在MTBE (甲基叔丁基醚)中沉淀分離。胍丁胺硫酸鹽在隨后的步驟中與中間體 A 縮合，制備側(cè)鏈保護(hù)的線性 FE 201836。然而，胍丁胺硫酸鹽難溶于普通有機(jī)溶劑，不能直接與濃度合適的多肽溶液偶聯(lián)。因此，胍丁胺硫酸鹽首先在水溶液中用 2 equiv NaOH 中和，然后凍干分離；通過如此手段獲得的free base 胍丁胺硫酸鹽溶解在 DMF 中（1.92當(dāng)量），與 1當(dāng)量的多肽中間體 A ，在1.05 當(dāng)量 PyBOP和 2.5當(dāng)量的 DIPEA（二異丙基乙胺）存在下進(jìn)行液相縮合反應(yīng)，組裝側(cè)鏈保護(hù)的線性 FE 201836。后者受到TFA（三氟乙酸）/TIS（三異丙基硅烷）/H2O的脫保護(hù)處理得到線性 FE 201836。在隨后的酰胺環(huán)化反應(yīng)中，線性 FE 201836多肽的羧酸與氨基在1.3 equiv HBTU 作用下對接，并合成目標(biāo)FE 201836多肽。FE 201836的流程合成Scheme 3 所示。Scheme 3. Free base 胍丁胺介導(dǎo)的FE 201836合成路線 （a: 固相多肽合成; b: 10% HFIP/DCM; c: freebase agmatine/PyBOP/DIPEA/DMF; d: TFA/TIS/H2O; e: HBTU/DIEPA/DMF）Free base胍丁胺的偶聯(lián)反應(yīng)在室溫下2小時(shí)內(nèi)完成。側(cè)鏈保護(hù)線性 FE201836中間 產(chǎn)品經(jīng) RP-HPLC 分析，檢測到兩個(gè)豐度為 9.5 和 10.9% 的雜質(zhì)。LC/MS 分析顯示它們可能是異構(gòu)體 1，以及通過胍丁胺交聯(lián)的側(cè)鏈保護(hù)線性 FE 201836 二聚體 2。隨后，該側(cè)鏈保護(hù)的線性 FE 201836 中間品粗產(chǎn)物用濃縮的 TFA 溶液以去除保護(hù)基團(tuán)。同時(shí)產(chǎn)生的線性 FE 201836 位置異構(gòu)體雜質(zhì) 3 和胍丁胺交聯(lián)的線性 FE 201836 二聚體，其化學(xué)結(jié)構(gòu)的認(rèn)證得到NMR數(shù)據(jù)的支持。該位置異構(gòu)雜質(zhì)和二聚雜質(zhì)產(chǎn)生的根本原因在于多肽中間體 A 的羧基與胍丁胺胍基之間的反應(yīng)。一般認(rèn)為，胍基的親核性在酸性到弱堿性的情況下基本上受到抑制。胍基的親核性在普遍有機(jī)反應(yīng)的pH 條件下通過質(zhì)子化顯著減弱。然而，胍化合物被視為超級(jí)有機(jī)堿并具有明顯的親核性，這種性質(zhì)可以賦予它們親核催化劑的作用。在本課題反應(yīng)中，胍丁胺中的胍基在與肽分子偶聯(lián)之前被中和，其親核性被喚醒。去質(zhì)子化的胍基因此與其4-氨基形成競爭反應(yīng)，與肽分子上羧基反應(yīng)而形成位置異構(gòu)體雜質(zhì) 1。這個(gè)過程原則上類似于在 Fmoc-Arg-OH在其羧基活化過程中的內(nèi)酰胺副反應(yīng)。位置異構(gòu)雜質(zhì) 1上有一個(gè)未配對的氨基，可以在反應(yīng)中與另一個(gè)多肽中間體 A 肽分子作用，產(chǎn)生胍丁胺交聯(lián)的二聚體雜質(zhì) 2 （Scheme 4）。Scheme 4. Free base 胍丁胺介導(dǎo)的位置異構(gòu)體以及二聚體雜質(zhì)的形成過程。線性 FE 201836 位置異構(gòu)體雜質(zhì)的命運(yùn)研究 （Fate Study）值得注意的是，側(cè)鏈保護(hù)的線性 FE 201836 位置異構(gòu)體 1 會(huì)干擾后續(xù)環(huán)化反應(yīng)。在經(jīng)過TFA處理后，所得線性 FE 201836 位置異構(gòu)體 3 帶有一個(gè)羧基和兩個(gè)氨基，理論上可以引發(fā)兩種位置異構(gòu)雜質(zhì)（異構(gòu)體A和B)（Scheme 5）。此外，線性 FE 201836 位置異構(gòu)體 3 也可以在環(huán)化步驟中與另一個(gè)分子 3 或普通線性 FE 201836分子4作用，分別產(chǎn)生六種或四種二聚雜質(zhì) (Scheme 6)。Scheme 5. 由側(cè)鏈保護(hù)的線性FE 201836位置異構(gòu)體雜質(zhì)1 所引發(fā)的FE 201836 異構(gòu)體 A/B 的形成。Scheme 6. 兩分子線性FE 201836位置異構(gòu)體雜質(zhì)3形成的二聚體雜質(zhì)，以及一分子線性FE 201836位置異構(gòu)體雜質(zhì)3與一分子線性FE 201836形成的二聚體雜質(zhì)。探尋從中間體里檢測到的異構(gòu)雜質(zhì)的命運(yùn)總是很有必要的，包括它們在隨后的合成步驟中的轉(zhuǎn)化，最終異構(gòu)體雜質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)，這些異構(gòu)體雜質(zhì)在產(chǎn)品中的可檢測性和去除率。為此，通過色譜純化分離得到線性FE 201836位置異構(gòu)體雜質(zhì)3，并作為反應(yīng)物進(jìn)行接下來的環(huán)化。通過LC/MS分析產(chǎn)物，異構(gòu)體 A 和異構(gòu)體B被檢測出，其豐度為60.8% 和5.1%（對應(yīng)性并不確定）。FE 201836 異構(gòu)體 A 和 B 均有一個(gè)未配對的氨基，它們可能在環(huán)化反應(yīng)中與過量的 HBTU 反應(yīng)，轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的胍對應(yīng)物（Scheme 7）。如此得到的amidinated異構(gòu)體 A 和 B 均已在粗品中檢測到，其中之一的含量高達(dá) 23.0%。此外，在反應(yīng)混合物中檢測到二聚體，這應(yīng)該歸因于由線性 FE 201836 異構(gòu)體所誘導(dǎo)六種可能的異構(gòu)二聚體之一（Scheme 6）。因?yàn)檫@六個(gè)二聚體雜質(zhì)中的每一個(gè)都有一個(gè)未配對的氨基，它們?nèi)匀蝗菀资艿紿BTU的amidination的影響。事實(shí)上，在粗產(chǎn)物中已經(jīng)檢測到2 個(gè)amidinated的異構(gòu)二聚體。Scheme 7. FE 201836異構(gòu)體A/B的amidination產(chǎn)物。綜合以上實(shí)驗(yàn)和分析可以得出的結(jié)論是，線性 FE 201836 位置異構(gòu)體可以進(jìn)行多種反應(yīng)，包括環(huán)化、二聚化和amidination。兩個(gè)線性 FE 201836 位置異構(gòu)體雜質(zhì)之間的二聚化實(shí)際上是有利于目標(biāo)肽的合成，因?yàn)閮蓚€(gè)位置異構(gòu)體雜質(zhì)被消耗以形成另一種二聚體雜質(zhì)，該二聚體雜質(zhì)可以通過色譜純化從產(chǎn)品中輕松去除。然而，線性 FE 201836位置異構(gòu)體也可以與線性FE 201836分子二聚化而形成混合二聚體，如Scheme 6 所示。此類副反應(yīng)消耗線性 FE 201836 分子并降低反應(yīng)收率。命運(yùn)研究得出的最突出結(jié)論是，由線性 FE 201836 位置異構(gòu)體雜質(zhì)所導(dǎo)致的FE 201836 異構(gòu)體A/B，以及二聚雜質(zhì)，一旦形成，可以采用反相高效液相色譜法檢測到，其檢測方法具有高可檢測性并明確區(qū)別于目標(biāo)產(chǎn)品 FE 201836。因此，從FMEA 的視角（Failure Mode Effect Analysis），產(chǎn)品質(zhì)量的完整性將通過如此高的可檢測性得以保障，因?yàn)樗鼈兊娜コ梢悦鞔_地遵循和評(píng)估。通過 Bis-Boc-胍丁胺合成FE 201836鑒于由free base胍丁胺所引發(fā)的位置異構(gòu)體雜質(zhì)，以及該工藝的低收率和低粗品低純度（71.0%），應(yīng)該在FE 201836 合成中使用合適的胍丁胺替代品。胍基上的 Boc 保護(hù)基團(tuán)可以顯著提高提高母體胍丁胺分子在有機(jī)物溶劑中的溶解度，因此可以避免不必要的胍基中和步驟。實(shí)際上，F(xiàn)moc-Arg(Boc)2-OH 已經(jīng)廣泛用作肽合成。同樣，Bis-Boc-胍丁胺也被認(rèn)為是FE 201836合成中一種潛在可行的構(gòu)建塊，以繞過胍丁胺硫酸鹽中和的步驟，并徹底避免各種位置異構(gòu)體和相關(guān)二聚雜質(zhì)的形成。Bis-Boc-胍丁胺定向合成FE 201836的過程如Scheme 8 所示。Scheme 8. Bis-Boc-Agmatine 引導(dǎo)的 FE 201836 合成路線 (a: Bis-Boc-agmatine/PyBOP/DIPEA/DMF; b: TFA/TIS/H2O; c: HBTU/DIEPA/DMF).事實(shí)證明，1.05 equiv bis-Boc-agmatine， 1.05 equiv PyBOP 和 2.5 equiv DIPEA足以使縮合反應(yīng)在室溫條件下 30 分鐘內(nèi)完成。在這個(gè)過程中沒有異構(gòu)體或二聚體雜質(zhì)產(chǎn)生。得到純度為 92.8% 的中間體 5，未校正的收率為 96.7%。使用由 60 equiv TFA, 1.5 equiv TIS 和 6 equiv H2O溶液對 多肽5 進(jìn)行脫保護(hù)，得到純度為 91.0%線性 FE 201836 中間體，其未校正收率為100%。所得的線性 FE 201836通過“偽高稀釋策略“環(huán)化反應(yīng)獲得最終產(chǎn)品 FE 201836，粗品純度為 87.8%，在這個(gè)過程中產(chǎn)生的常規(guī)二聚雜質(zhì)小于含量 1.5%。粗品通過 LC/MS進(jìn)行分析，不含環(huán)狀異構(gòu)體、amidinated二聚體、胍丁胺交聯(lián)二聚體、和二聚體異構(gòu)體。粗品純度從 70.9%（free base 胍丁胺工藝）顯著提高到 87.8%（Bis-Boc-胍丁胺），并且下游純化工藝的復(fù)雜性明顯減輕。Bis-Boc-胍丁胺代替free base胍丁胺因此全局顯著優(yōu)化了整體生產(chǎn)工藝。
在本研究闡述了胍丁胺中胍基所引發(fā)的副反應(yīng)。來自free base胍丁胺的去質(zhì)子化胍基與其4-氨基產(chǎn)生競爭反應(yīng)，產(chǎn)生位置異構(gòu)雜質(zhì)。該位置異構(gòu)雜質(zhì)上的未配對氨基可以參加合成路線上的下游反應(yīng)并形成多種雜質(zhì)。Bis-Boc-胍丁胺，可以很容易地制備并應(yīng)用于胍丁胺肽的合成。在這個(gè)過程種沒有引發(fā)異構(gòu)雜質(zhì)和相關(guān)二聚體雜質(zhì)。胍基官能團(tuán)上的雙 Boc 保護(hù)基團(tuán)可以很容易地被 TFA 定量去除。使用Bis- Boc-胍丁胺原料合成FE 201836可以顯著提高產(chǎn)品純度和產(chǎn)率。這項(xiàng)研究還強(qiáng)調(diào)了中間產(chǎn)品異構(gòu)雜質(zhì)的研究方法，這種理念和策略對于確保API 產(chǎn)品質(zhì)量的完整性至關(guān)重要。
文獻(xiàn)詳情：
Yi Yang* and Lena Hansen. Regioisomer Formation with Agmatine Guanidino Group, Its Implications for Agmatine Peptide Cyclization, and Application of Bis-Boc-Agmatine. Organic Process Research & Development. 2022. https://doi.org/10.1021/acs.oprd.2c00098
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