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Org.?Process?Res. Dev.：通過DOE抑制 SPPS 中同時 Fmoc-His(Trt)-OH 消旋和 Nα-DIC 封端，其對肽合成中氨基酸活化策略的意義

來源：化學加網原創      2022-08-05
導讀：在固相多肽合成中偶聯 Fmoc-His(Trt)-OH 經常伴隨著明顯的外消旋化。組氨酸是在肽合成中傾向于外消旋的最敏感的氨基酸殘基之一。在本研究中，利用色譜純化不能有效清除D-His外消旋雜質。因此，DOE被使用以降低該His外消旋 。導出的 DOE 模型揭示了 Fmoc-His(Trt)-OH 的預活化對其外消旋產生重要影響。強化 Fmoc-His(Trt)-OH 預活化會激化這種副反應。另一方面，沒有氨基酸預活化，采用 in situ Fmoc-Xaa-OH活化，另一個副反應，即N，N二異丙基碳二亞胺封端(Nα-DIC-封端)被提升。組氨酸消旋化和多肽 Nα 封端之間存在矛盾關系通過 DOE 調查發現。建立了組氨酸消旋和多肽Nα-DICF封端的重要模型在此基礎上完成封端和調和以平衡這兩種副反應。

正文


介紹
Fmoc-His(Trt)-OH 是最容易外消旋的多肽合成中的氨基酸。如此高的不穩定性是主要歸因于其側鏈不受保護的咪唑基Nπ可以在分子內 進攻Hα ，而后者的酸度會隨著 Fmoc-His(Trt)-OH的活化而增強。所得碳負離子的再質子化導致 His-Cα 消旋化（Scheme 1）。

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Scheme 1. Fmoc-His(Trt)-OH 活化和由 His-Nτ 引導的偶聯過程中組氨酸的消旋化。
總的來說，在 多肽固相合成(SPPS) 中可實施兩種氨基酸活化策略，即原位 in situ活化和預活化。在原位活化策略中，將 Fmoc-Xaa-OH 和偶聯劑依次添加到底物肽樹脂中，而無需預先混合。Fmoc-Xaa-OH在偶聯試劑存在下 與肽-Nα 的偶聯以一鍋法發生。因此，在原位活化策略中，活化的 Fmoc-Xaa-OH 的存在期被最小化。反之，當采用預活化策略時，Fmoc-Xaa-OH 和偶聯劑在偶聯反應之前混合。預活化過程通常需要幾分鐘才能將 Fmoc-Xaa-OH 轉化為其相應的活化物質。當預活化到期時，將活化的 Fmoc-Xaa-OH 添加到肽樹脂中以啟動目標偶聯反應。
盡管原位活化策略可以有效縮短活化的 Fmoc-Xaa-OH 物種的存在期，這可能有助于緩解氨基酸外消旋化，但預活化策略仍被工業界廣泛采用。這是考慮到偶聯試劑和肽-Nα 部分之間的副反應導致的肽鏈終止，uronium和碳二亞胺偶聯劑可以將伯氨基和仲氨基轉化為相應的胍物質（Scheme 2）。
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Scheme 2. DIC 介導的 Fmoc-Xaa-OH 活化/偶聯和封端終止肽鏈副反應
結果與討論
在該研究項目中，一個Fmoc-His(Trt)-OH 縮合反應所導致的消旋化副反應被以DOE的方式進行研究優化。DIC/HOBt被用作縮合試劑和縮合添加劑。已知氨基酸預活化溫度、時間和偶聯反應溫度對于氨基酸偶聯的各種特征雜質的形成具有潛在的關鍵性。在全因子DOE (full factorial design)設計中，三個研究參數的范圍，即耦合溫度、預活化溫度和預活化時間，指定為[10°C，30°C]，[10°C，30 °C] 和 [1 分鐘，20 分鐘]?？偣矊嵤┝?11 次實驗，包括整個設計空間的三個中心點復制，以測試曲率并估計純誤差。設計的響應包括 D-His(Trt) 和 DIC-封端 雜質。11個DOE實驗結果在Table 1中顯示。
Table 1. DIC/HOBt·H2O 的 Fmoc-His(Trt)-OH 耦合的 DOE實驗結果

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D-His 模型
D-His 模型（Figure 1）顯示，預活化時間和預活化溫度在 Fmoc-His(Trt)-OH 消旋化中起最重要的作用。此外，預活化溫度和預活化時間之間的相互作用強烈影響 D-His 雜質含量。其他重要因素，即耦合溫度以及耦合溫度和預活化時間之間的相互作用，影響相對較小。這些發現在機制上是合理的，因為氨基酸的外消旋化主要發生在其羧酸鹽被活化時。氨基酸被預活化的程度越強，例如在高溫下和預活化時間延長，其外消旋作用就越大。
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Figure 1. D-His 雜質與預活化溫度/預活化時間的 3D 表面圖（耦合溫度恒定為 20 °C）。
鑒于預活化時間的突出關鍵性，需要將此參數控制在低水平，以確保 D-His 雜質低于目標含量 2.0%。一旦預活化時間為一分鐘，預測的 D-His 雜質含量將在設計空間內一致小于 2.0%。如果預活化溫度和偶聯溫度都設置在低水平，它甚至可以降低到 1.0% 以下。如果將預活化時間延長至十分鐘，則組氨酸外消旋化保持在2.0%以下的概率將大大降低，而當預活化超過二十分鐘時，這一目標幾乎無法實現（Figure 2）。
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Figure 2. D-His 雜質與耦合溫度/預活化溫度的 3D 表面和等高線圖，預活化時間為常數（從左到右分別為 1、10、20 分鐘）。
DIC-封端 模型
DIC-封端模型表明，預活化時間是DIC 封端副反應的最關鍵參數，其次是耦合溫度。與 D-His 模型相反，預活化溫度和預活化時間對 DIC 封端的主要影響為負，表明通過單獨增加預活化溫度或預活化時間 的方法，DIC-封端雜質會減少（Figure 3）。
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Figure 3. DIC 封端雜質與預活化溫度/預活化時間的 3D 表面圖（耦合溫度恒定為 20 °C）。

總結

Fmoc-His(Trt)-OH在偶聯反應過程中高度傾向于消旋化。本研究中的 D-His 肽雜質對純化過程提出了明顯的挑戰。通過DIC/HOBt·H2O/DMF耦合方法三因子兩水平全因子DOE設計，對 Fmoc-His(Trt)-OH 偶聯進行了優化，以將外消旋化降低到 2.0%。所有三個研究的參數，即耦合溫度、預活化溫度和預活化時間，在D-His以及DIC-封端的兩個模型中都很重要，并且預活化時間在這兩種情況下都是最顯著的因素。雙因素相互作用（耦合溫度*預活化時間）和（預活化溫度*預活化時間）對 D-His 模型是顯著的，而（耦合溫度*預活化溫度）對于 DIC 封端模型是顯著的。預活化時間/預活化溫度與 D-His/DIC 封端之間的相關性是相反的。更長的預活化時間和預活化溫度將減弱 DIC 封端，但會加劇組氨酸外消旋化。

鑒于在本研究中 D-His 抑制比 DIC 封端具有更高的優先級，因此設置了有利于 D-His 最小化的工藝參數。輪廓圖疊加方法被操縱以針對能夠同時滿足 D-His (≤2.0%) 和 DIC 封端 (≤0.2%) 目標的參數設置。

具體來說，本研究最突出的發現總結如下：

? 組氨酸消旋取決于偶聯劑/添加劑和活化策略。

? 高溫和長時間的強化預活化會加劇組氨酸外消旋化。

? DIC 封端伴隨氨基酸偶聯過程中的氨基酸外消旋。

? 通過提高預活化溫度和延長預活化時間進行充分的氨基活化可以減少 DIC 封端和其他相關副反應。

文獻詳情：

Yi Yang*, Lena Hansen, Alberto Baldi. Suppression of Simultaneous Fmoc-His(Trt)-OH Racemization and Nα-DIC-Endcapping in Solid-Phase Peptide Synthesis through Design of Experiments and Its Implication for an Amino Acid Activation Strategy in Peptide Synthesis. Organic Process Research & Development. 2022. https://doi.org/10.1021/acs.oprd.2c00144 

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