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由于全球老年人癡呆癥患病率不斷上升以及對社會的影響越來越大，阿爾茨海默癥(AD)已經(jīng)引起了越來越多的關(guān)注，其中對AD發(fā)病機制和診斷方法的研究一直處于醫(yī)學和腦科學的前沿。目前，AD的診斷主要基于使用多種常規(guī)神經(jīng)心理學測試和醫(yī)療器械(CT、PET、MRI)進行的臨床評估。此外，臨床上還包括對血漿或腦脊液中的生物標志物的檢查，以估計疾病的發(fā)展進程。但是，這些方法都很難滿足AD診斷所需的敏感性、特異性和非侵入性。

熒光成像因其高靈敏度、微創(chuàng)和實時響應(yīng)的特性而在生物分析領(lǐng)域引起了廣泛的關(guān)注。在此背景下，針對AD生物標志物設(shè)計的熒光探針將為AD診斷和病理分析提供強有力的工具。當前，對AD早期診斷的研究大多集中在Aβ肽或tau蛋白上，而很少能夠在活體水平上揭示氧化應(yīng)激與AD之間的復(fù)雜關(guān)系。作為超氧自由基和一氧化氮的組合產(chǎn)物，過氧亞硝酸鹽(ONOO^-)是一種典型的氧化應(yīng)激反應(yīng)物種，已有證據(jù)表明，ONOO^-通過引發(fā)神經(jīng)毒性和神經(jīng)炎癥在AD的發(fā)病機制中起重要作用。但是，迄今為止，還沒有ONOO^-熒光探針可用于AD的活體腦成像。造成這種困境的一個主要原因可能是當前探針的血腦屏障(BBB)穿越能力不足。此外，由于大腦中產(chǎn)生的ROS種類繁多，也要求探針對ONOO^-具有優(yōu)異的選擇性。鑒于此，劉志洪教授團隊通過結(jié)構(gòu)調(diào)節(jié)策略合理設(shè)計了一種新穎的ONOO^-激活的近紅外發(fā)射熒光探針Rd-DPA3，旨在研究過氧亞硝酸鹽與AD之間的復(fù)雜關(guān)系，實現(xiàn)AD進展過程的體內(nèi)診斷和評估（圖1）。

圖 1. 探針Rd-DPA3的結(jié)構(gòu)及作用示意圖（圖片來源：Angew. Chem. Int. Ed.）

在探針分子的構(gòu)建中，首先基于前期工作中發(fā)展的二氨基取代的Rhodol染料(NIR-Rd-1和NIR-Rd-2)，作者利用剛性五元環(huán)鎖定類哌嗪類二氨基結(jié)構(gòu)并接枝氯原子開發(fā)了一種新型Rhodol染料NIR-Rd-3，其具有更長的近紅外發(fā)射波長。此外，考慮到ONOO^-的強氧化性和親核性，4, 4'-氮雜二基二苯酚被創(chuàng)新性地開發(fā)為對ONOO^-具有高選擇性的識別基團，進而連接到NIR-Rd-3熒光團上獲得了ONOO^-可激活的熒光探針Rd-DPA3。接著，作者首先通過滴定實驗驗證了探針Rd-DPA3對ONOO^-的響應(yīng)性能。在沒有ONOO^-存在的條件下，Rd-DPA3的最大吸收峰位于602 nm，同時在702 nm處顯示微弱的熒光。而在加入ONOO^-反應(yīng)后，Rd-DPA3在700 nm處的熒光顯著增強，同時吸收藍移至572 nm。重要的是，Rd-DPA3對ONOO^-表現(xiàn)出優(yōu)異的靈敏度和選擇性，檢測限低至3.4 nM，其他干擾物質(zhì)（金屬離子，pH，ROS, 蛋白質(zhì)）均不會引起探針在700 nm處的熒光增強。在不同pH條件下，探針均具有良好的穩(wěn)定性，并且能夠維持對ONOO^-出色的響應(yīng)能力（圖2）。

圖 2. Rd-DPA3對ONOO^-的光譜響應(yīng)（圖片來源：Angew. Chem. Int. Ed.）

然后，作者進一步通過高分辨質(zhì)譜研究了Rd-DPA3與ONOO^-的反應(yīng)機制。實驗結(jié)果證明，在單分子Rd-DPA3中，ONOO^-首先進攻雙氨基酚部分形成烷基胺修飾的熒光團，隨后烷基胺基團繼續(xù)與ONOO^-發(fā)生1, 3-消除反應(yīng)生成NIR-Rd-3。對于Rd-DPA3，4, 4'-氮雜二基二酚基團不僅是ONOO^-的反應(yīng)位點，而且還可以通過PeT效應(yīng)有效地淬滅NIR-Rd-3的熒光。此外，密度泛函理論(DFT)計算也與作者提出的檢測機制一致（圖3）。

圖 3. Rd-DPA3與ONOO^-反應(yīng)機制的探究（圖片來源：Angew. Chem. Int. Ed.）

接著，作者在活細胞中研究了探針Rd-DPA3的成像能力。首先，實驗結(jié)果表明該探針具有良好的生物相容性和線粒體定位性能，并且可以選擇性地反映活細胞中外源性和內(nèi)源性O(shè)NOO^-濃度的變化。由于金屬離子(Fe²⁺, Cu²⁺等)穩(wěn)態(tài)的紊亂與AD的進展密切相關(guān)，作者進一步通過在PC12細胞中添加Fe²⁺，模擬AD過程中由于金屬離子穩(wěn)態(tài)失衡所導(dǎo)致氧化應(yīng)激的細胞模型。。結(jié)果顯示，隨著Fe²⁺濃度的增加，細胞內(nèi)熒光逐漸增強，表明在Fe²⁺誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激過程中產(chǎn)生了ONOO^-。值得注意的是，加入尿素（UA，一種高效的ONOO^-清除劑）后，PC12細胞中的紅色熒光信號急劇降低，這表明UA有效降低了細胞內(nèi)ONOO^-水平。同時，這些實驗結(jié)果證明了Rd-DPA3能夠監(jiān)測AD細胞模型中ONOO^-的波動（圖4）。

圖 4. AD細胞模型中ONOO^-的監(jiān)測（圖片來源：Angew. Chem. Int. Ed.）

隨后，作者進行了活體成像的研究。首先，作者評估了探針的血腦屏障(BBB)穿透能力。經(jīng)計算，55.54%的Rd-DPA3成功穿透了人工模擬BBB，顯示出探針在體內(nèi)腦成像的巨大潛力。然后，探針經(jīng)過尾靜脈注射到各個實驗組的小鼠模型中。在AD模型小鼠中，熒光強度在0-6小時內(nèi)顯著升高，并在6-11小時內(nèi)保持穩(wěn)定；相比之下，在對照組中只能觀察到輕微的熒光增強，從而證明ONOO^-的過度表達是AD的標志之一。此外，為了確認注射后探針集中在小鼠大腦中，解剖小鼠大腦進行了離體NIR成像。體外成像結(jié)果表明，AD模型腦部的熒光強度遠高于對照組，進一步證實了探針在腦中的BBB穿越能力和ONOO^-檢測性能。同時，在氯碘羥喹或姜黃素（兩種著名的治療阿爾茨海默病的化學藥物）處理的AD小鼠中，腦部的實時熒光成像表明ONOO^-表達在0-12小時下降到低水平。這樣的結(jié)果表明Rd-DPA3可以通過測量大腦中的ONOO^-水平來幫助藥理學家研究藥物在治療阿爾茨海默病中的作用機制（圖5）。除此之外，作者進一步對不同年齡AD大腦中ONOO^-的積累進行了研究。3個月，8個月和12個月大的AD模型小鼠分別被注射了Rd-DPA3，并記錄了小鼠的實時成像。結(jié)果顯示，來自大腦的熒光信號隨著年齡的增長而顯著增加，為AD大腦中ONOO^-的年齡依賴性積累提供了體內(nèi)證據(jù)（圖6）。

圖 5. AD小鼠中ONOO^-的體內(nèi)成像（圖片來源：Angew. Chem. Int. Ed.）

圖 6. ONOO^-在年齡相關(guān)AD小鼠中的體內(nèi)成像（圖片來源：Angew. Chem. Int. Ed.）

湖北大學劉志洪教授團隊通過結(jié)構(gòu)調(diào)節(jié)優(yōu)化策略合理設(shè)計了一種過氧亞硝酸鹽(ONOO^-)可激活的熒光探針Rd-DPA3，其表現(xiàn)出優(yōu)異的靈敏度和選擇性。在細胞水平上，Rd-DPA3能夠靶向線粒體并監(jiān)測活細胞中ONOO^-濃度在氧化應(yīng)激過程的變化。此外，由于Rd-DPA3優(yōu)異的BBB穿透能力，首次在AD小鼠模型的大腦中成功實現(xiàn)了ONOO^-濃度波動的實時體內(nèi)成像，并證明了阿爾茨海默癥(AD)小鼠大腦中ONOO^-含量會隨年齡的增長呈現(xiàn)依賴性積累。該研究結(jié)果有力地支撐了ONOO^-可以作為AD的生物標志物，進一步促進了我們對AD診斷和治療的認識，為新型ONOO^-探針設(shè)計和AD診斷提供了新的方向。

文獻詳情：