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基于光誘導電子轉移(PeT)原理的傳感器通常是依賴于PeT進入激發態(受體PeT)或脫離激發態(供體PeT)進行信號傳輸的。近期，加州大學伯克利分校的Evan W. Miller教授課題組通過引入吸電子分子導線來反轉電子流動的方向，首次開發了供體PeT (d-PeT) 型電壓敏感熒光染料(VF)。在該設計中，含有吸電子基團的VF染料具有電壓敏感熒光特性，但是和受體PET (a-PET) 型電壓敏感熒光染料的極性是相反的，在超極化生物膜電位狀態下會增強熒光。相關成果以“Flipping the Switch: Reverse-Demand Voltage-Sensitive Fluorophores”為題發表于J. Am. Chem. Soc. (DOI: 10.1021/jacs.2c05385)。

生物膜電位(V_m)源于選擇性滲透脂質雙層中離子濃度的差異，是生命的決定性特征。使用熒光指示劑可視化細胞V_m為傳統電極方法提供了強大的補充，并力求解決與電生理學相關的低通量、空間分辨率差和侵入性問題。熒光染料長期以來一直用于監測生物學相關的分析物、反應和性質。光誘導電子轉移(PeT)的調控是設計熒光報告分子的有效方法，是通過基于與分析物（如離子和反應性代謝物）的結合或反應控制PeT進入或退出熒光團的激發態。

作者在前期研究中一直在探索基于PeT的傳感器來監控V_m。他們假設電壓敏感熒光團內的電壓敏感性來自于對V_m敏感的電子轉移，因此電子轉移的方向很重要。在超極化V_m下，當電子從質膜中的分子導線移動到細胞外表面的熒光團中時，會發生PeT，染料的發光得到淬滅；而在去極化的V_m下，電壓降低了PeT的速率，染料的熒光得到增強。與這一假設一致，電壓敏感熒光染料(VF)在膜去極化時具有熒光開啟響應、納秒響應動力學和電壓依賴性熒光壽命。當前，所有VF染料都是使用含苯胺的分子導線在受體PeT (a-PeT) 結構中實現電壓敏感性，其中熒光團充當電子受體。然而，如果關于電壓傳感機制的假設是正確的，用吸電子基團(EWG)代替富電子苯胺應該會降低導線的前沿分子軌道能量并實現供體激發的PeT (d-PeT)。在這種結構中，超極化的V_m會降低PeT的速率，因而導致超極化電位下的熒光增亮（圖1）。基于此，作者計算了一系列含有EWG取代基的分子導線的HOMO/LUMO能量，合成了5種新的EWG-VF染料，表征了它們的光譜特性，并評估了它們在哺乳動物細胞中的電壓敏感性。其中，兩種新染料顯示出電壓敏感性，但相對于先前報道的含苯胺的VF染料極性相反（圖2）。

圖 1. 電壓敏感熒光團中的PeT過程（圖片來源：J. Am. Chem. Soc.）

圖 2. 含EWG的VF染料的合成（圖片來源：J. Am. Chem. Soc.）

首先，為了研究通過d-PeT反轉VF染料極性的可能性，作者進行了密度泛函理論(DFT)計算以預測正交熒光團和分子導線體系中的相對HOMO/LUMO能量 （圖3）。對于像4-NO₂-VF這樣的EWG-VF染料，作者發現4-NO₂-VF的導線LUMO比熒光素LUMO低-0.58 eV，表明可能存在d-PeT。同時，作者計算了包含其他EWG的分子導線的軌道能量。其中，4-NO₂-VF和2,4-diNO₂-VF都具有大約-0.6 eV或更大的LUMO?LUMO (L?L) 間隙。基于此，作者認為用4-NO₂和2,4-diNO₂等強EWG取代可能會生成d-PeT VF染料。

圖 3. 密度泛函理論(DFT)計算（圖片來源：J. Am. Chem. Soc.）

為了驗證VF染料可以“反向運行”的假設，作者合成了5種不同的EWG取代的二苯乙烯衍生物。由于具有相同的熒光團，所有EWG-VF染料的最大吸收均位于511 nm處，最大熒光發射位于527 nm （圖4），而染料的熒光量子產率范圍為0.09-0.71。其中，4-NO₂-VF和2,4-diNO₂-VF都具有低熒光量子產率，表明了高度的PeT淬滅效應。而且，在高濃度硫醇（2 mM谷胱甘肽）的存在情況下，EWG-VFs表現出優異的穩定性。

圖 4. VF染料的光譜性質（圖片來源：J. Am. Chem. Soc.）

接著，實驗表明所有EWG-VF染料都可染色HEK293T細胞的質膜（圖5），4-NO₂-VF的膜染色最亮。然后，作者使用全細胞膜片鉗電生理學評估了HEK293T細胞中新型EWG-VF染料的電壓敏感性（圖6）。結果顯示，具有4-NO₂取代基的EWG-VF染料表現出電壓敏感性，但極性相反，4-NO₂-VF和2,4-diNO₂-VF 的熒光在去極化時降低，在超極化時變得更亮。但是，2,4-diNO₂-VF在細胞中顯示出非常弱的熒光，比4-NO₂-VF低約40倍，因此作者利用4-NO₂-VF進一步監測了大鼠海馬神經元中的誘發動作電位(AP)。在單次試驗中，4-NO₂-VF報告的AP平均ΔF/F為-1.3%±0.14，信噪比(SNR)為9.1±1.0。對神經元AP去極化的反應是熒光降低，表明d-PeT指示劑能夠在復雜的細胞環境中起作用。

圖 5. 細胞成像（圖片來源：J. Am. Chem. Soc.）

圖 6. 含EWG的VF染料在活細胞中的電壓敏感性（圖片來源：J. Am. Chem. Soc.）

接著，在比-100 mV更負的超極化電位下，4-NO₂-VF變得更亮，實現了+2.4%的超極化開啟響應。在極端超極化電位下，光學響應偏離-100和+100 mV之間觀察到的線性。超極化電位在抑制性神經傳遞中發揮重要作用，更廣泛地說，在線粒體的生理學中發揮重要作用，其中靜息線粒體電位在-100 -200 mV的范圍內。最后，作者證明了4-NO₂-VF可用于V_m動態的雙色映射，表明d-PeT方法能夠提供快速響應動力學并且與雙色成像兼容（圖 7）。

圖 7. 4-NO₂-VF在超極化電位下的電壓敏感性（圖片來源：J. Am. Chem. Soc.）

加州大學伯克利分校的Evan W. Miller教授課題組報道了基于d-PeT的電壓敏感熒光染料的設計、合成和驗證。在該工作中，作者合成了5種不同的吸電子基團取代的熒光染料，表征了它們的光譜特性，并評估了它們在哺乳動物細胞中的電壓敏感性。其中4-NO₂-VF和2,4-diNO₂-VF都是電壓敏感的，可作為超極化的開啟指示器。而且，4-NO₂-VF被成功應用于活細胞中，在超極化生物膜電位狀態下顯示出增強的熒光信號。

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