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Angew.北大王晶團隊通過發展比例型熒光生物傳感器揭示線粒體內GTP/GDP Ratio的動態調控
來源：北京大學 2022-06-30
導讀：近日，北京大學藥學院天然藥物及仿生藥物國家重點實驗室王晶團隊在學術期刊《Angewandte Chemie International Edition》發表了題為“Monitoring the Dynamic Regulation of the Mitochondrial GTP-to-GDP Ratio with a Genetically Encoded Fluorescent Biosensor”（開發遺傳編碼的生物熒光探針監測線粒體中GTP與GDP比值的動態變化）的研究工作。
GTP和GDP的代謝和轉化在廣泛的生物學過程中發揮關鍵作用，能夠為生物合成提供能量，或參與廣泛的信號轉導。GTP和GDP的代謝和轉化廣泛存在于這些相關的生理過程或病理過程中，通常由復雜的酶系統調節，因而GTP/GDP比值可以作為細胞信號轉導和能量代謝狀態變化的敏感且重要的指標。然而，針對GTP和GDP比值指標的活細胞動態監測始終是一項極具挑戰性的難題。更為重要的是，相比較檢測GTP或GDP絕對濃度獲得的能量代謝的信息，精準檢測細胞內GTP與GDP的相對濃度可以更好地解釋鳥苷酸能量代謝變化的生物學意義。因此，發展一種光學工具來實時報告活細胞的GTP/GDP比率具有非常重要的科學意義和應用價值。
基于此，北京大學藥學院王晶團隊，利用遺傳編碼的熒光蛋白傳感器技術實現了對GTP/GDP比率的時空特異性和實時動態監測。探針設計選擇Ct-eIF5B的結構域Ⅰ作為“GTP/GDP感知元件”，繼而將“報告元件”循環重排黃色熒光蛋白（cpYFP）插入到Ct-EIF5B的結構域Ⅰ中，cpYFP會對其N端或C端的蛋白結構變化敏感，當GTP或GDP與該融合蛋白（GRIser）結合后，會誘導蛋白構象變化，從而產生相應的熒光信號。此外本研究利用計算機輔助設計和蛋白分子定向進化技術，對該GTP/GDP比值的熒光探針進行了深度優化。通過對突變位點設計高效完整的篩選工作流程，并綜合評價各個突變體的響應幅度、親和力等體外特征，開發了性能優良的遺傳編碼的GTP/GDP比值的熒光探針（GRIserHR）。GRIserHR具有極好的熒光穩定性、選擇性和敏感性（亞微摩爾）。隨后，該團隊通過引入適當的信號肽與傳感器融合，構建得到GRIserHR的突變體，從而實現了對活細胞內亞細胞區室中的GTP/GDP比值的監測，為實時動態研究活細胞中亞細胞尺度的GTP/GDP比值奠定了堅實基礎。同時，該團隊還將GRIserHR用于探究PEPCK-M和SCS酶功能擾動后是如何差異性地調控胞質和線粒體GTP/GDP比值的水平。實驗結果表明線粒體中GTP/GDP比值獨立于細胞質GTP/GDP比值的變化。總之，利用GRIserHR探針可以加強對線粒體代謝機制的深入理解，以及通過發現影響 GTP-GDP相互轉換的特異性靶標，展開激活劑和抑制劑的高通量篩選工作。本工作也為GTP/GDP比值作為代謝動態指標提供了確鑿的證據，進一步完善了中心碳代謝分子研究的監測工具庫。北京大學藥學院研究員王晶研究員為本研究論文的通訊作者。北京大學藥學院博士研究生張美琪和北京大學藥學院六年制研究生楊波為論文的共同第一作者。該工作得到科技部重點研發計劃和國家自然科學基金委等項目資助。左起：張美琪（博士研究生），王晶（研究員），楊波（六年制碩士研究生）原文鏈接：https://doi.org/10.1002/anie.202201266王晶，博士，北京大學藥學院研究員、博士生導師、天然藥物及仿生藥物國家重點實驗室PI。入選國家海外高層次人才計劃。長期致力于利用化學生物學方法研究小分子對生物大分子的調控機制和開發相應的基于遺傳編碼的生物熒光探針。至今以第一作者或通訊作者身份在Nat. Chem.、Nat. Biotechnol.、Angew. Chem. Int. Ed. 等國際重要學術期刊上發表多篇學術論文。
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