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細胞是構(gòu)成生命的基本單元，發(fā)展適用于活細胞的生物正交反應(yīng)、并由此開發(fā)活細胞原位研究的化學(xué)技術(shù)已成為化學(xué)與生命科學(xué)交叉融合的研究前沿。生物正交反應(yīng)是指可以在生命體系中進行、且不會與生命過程相互干擾的一類化學(xué)反應(yīng)。生物正交反應(yīng)為研究者對生命進程的研究帶來了革命性的技術(shù)，同時也為醫(yī)學(xué)研究、臨床診斷、新藥研發(fā)等提供了開創(chuàng)性方法，已成為化學(xué)生物學(xué)領(lǐng)域的核心方向之一。北京大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院陳鵬/樊新元課題組長期致力于活細胞化學(xué)反應(yīng)的開發(fā)與應(yīng)用研究，突破了在活細胞內(nèi)研究蛋白質(zhì)的技術(shù)瓶頸，開拓了生物正交反應(yīng)和應(yīng)用的新方向。近期，該實驗室進一步拓展活細胞化學(xué)反應(yīng)的應(yīng)用前沿與邊界，在細胞凋亡的生物正交調(diào)控、細胞相互作用的原位-實時捕獲以及新冠病毒表面的“共價反應(yīng)”抗體等方向取得了系列進展。

圖1. 基于生物正交脫籠反應(yīng)的BaseBAC技術(shù)，可原位、實時觸發(fā)細胞焦亡 (J. Am. Chem. Soc. 2022, DOI: 10.1021/jacs.1c12924）

細胞焦亡是由gasdermin（GSDM）家族蛋白在經(jīng)過蛋白酶剪切C端結(jié)構(gòu)域后，其N端結(jié)構(gòu)域釋放并在細胞膜上寡聚打孔而產(chǎn)生的一種細胞死亡方式。如何實現(xiàn)可控的細胞焦亡是進一步研究這一死亡類型的分子機制，拓展其在腫瘤等疾病治療領(lǐng)域應(yīng)用的關(guān)鍵問題。然而，GSDM 的N端結(jié)構(gòu)域具有很強的毒性，很難在細胞內(nèi)直接表達和調(diào)控。近年來，研究人員通過在半催化失活的nCas9上融合胞嘧啶脫氨酶（APOBEC1），開發(fā)出了可以對目標(biāo)堿基進行從C到T轉(zhuǎn)化的胞嘧啶堿基編輯器（CBE）。陳鵬/樊新元課題組報導(dǎo)了利用該堿基編輯器在開放閱讀框中實時引入終止密碼子的技術(shù)BaseBAC（圖1），可通過限制C端結(jié)構(gòu)域的表達，實現(xiàn)目標(biāo)蛋白質(zhì)N端“截短體”的原位、實時表達，并激活細胞焦亡通路。這一基于生物正交剪切反應(yīng)技術(shù)，依賴于其nCas9結(jié)構(gòu)域識別PAM序列并進行底物序列的查驗。因此，作者在他們前期開發(fā)的蛋白質(zhì)脫籠技術(shù)的基礎(chǔ)上，進一步將IEDDA生物正交剪切反應(yīng)拓展到蛋白質(zhì)和DNA結(jié)合的化學(xué)調(diào)控，通過調(diào)控dCas9與PAM序列結(jié)合來調(diào)控CBE引入終止密碼子，進而通過生成GSDME的N端蛋白觸發(fā)細胞焦亡。該體系在活細胞和活體小鼠中均展示出了優(yōu)異的兼容性和調(diào)控能力。由于該技術(shù)針對Cas9與底物DNA的結(jié)合調(diào)控而開發(fā)，理論上適用于各種Cas9衍生的基因編輯工具，包括Adenosine Base Editor以及Prime Editor等。另一方面，細胞中含有多種在表達時為自抑制狀態(tài)的基因，其功能亦可以通過編程BaseBAC而進行原位、特異激活。此外，IEDDA反應(yīng)具有良好的生物兼容性，使其能應(yīng)用于多種生物學(xué)研究場景，具有廣闊的應(yīng)用前景。

圖2. 基于生物正交光催化反應(yīng)的PhoXCELL技術(shù)，可實現(xiàn)細胞-細胞相互作用的原位捕獲和定量鑒定(J. Am. Chem. Soc. 2022, DOI: 10.1021/jacs.2c00159)

細胞-細胞相互作用是生命過程中最基本的信息傳遞方式之一，尤其在免疫、神經(jīng)等系統(tǒng)的生理過程中承擔(dān)著重要的角色。發(fā)展研究細胞-細胞相互作用的工具可以幫助免疫學(xué)家更好地研究免疫過程、調(diào)控細胞治療方法。然而，目前的工具都基于鄰近標(biāo)記酶，缺乏時空可控性，且通常需要對免疫細胞（或小鼠）進行基因改造，技術(shù)門檻較高。此外，這些工具對細胞間相互作用的定量研究尚處于起步階段。陳鵬課題組與南京大學(xué)李劼課題組合作，發(fā)展了一種快速、高效鑒定細胞-細胞相互作用的定量工具PhoXCELL(Photocatalytic proXimity CELl Labeling, 圖2）。該技術(shù)基于光催化的小分子鄰近標(biāo)記工具DBF（dibromofluorescein），通過光催化產(chǎn)生單線態(tài)氧觸發(fā)標(biāo)記反應(yīng)，可以在T細胞與樹突狀細胞（DC）的相互作用中，實現(xiàn)對抗原特異性T細胞的精確捕獲。具體來說，PhoXCELL可以時空特異地捕獲抗原特異性T細胞；同時，PhoXCELL還可以定量評價細胞-細胞間的相互作用，并能在腫瘤和癌旁淋巴結(jié)中同時捕獲腫瘤抗原特異性CD8+和CD4+ T細胞。作者利用PhoXCELL技術(shù)在小鼠三陰性乳腺癌模型E0771中捕獲腫瘤相關(guān)抗原特異性T細胞。通過將DBF展示在吞噬并遞呈有腫瘤抗原的DC上，成功的在腫瘤浸潤淋巴細胞和癌旁淋巴結(jié)中同時捕獲到了腫瘤抗原特異性CD8+和CD4+ T細胞。被捕獲到的細胞均高表達PD-1和CD39，且ELISPOT實驗進一步證明，這群細胞的確可以特異性識別腫瘤相關(guān)抗原。

圖3. 基于鄰近化學(xué)交聯(lián)反應(yīng)的GlueBinder技術(shù)，可用于防止新冠病毒突變產(chǎn)生的抗體逃逸 (J. Am. Chem. Soc. 2022, DOI: 10.1021/jacs.1c11554)

自2019年底新冠病毒疫情爆發(fā)以來，靶向新冠病毒受體結(jié)合域（RBD）并阻斷其與人體血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2（ACE2）相互作用的中和抗體得到了廣泛關(guān)注與應(yīng)用。但是新冠病毒的變異速度之快，使得逃逸突變不斷累積，眾多基于阻斷RBD-ACE2結(jié)合的中和抗體減弱或喪失了阻斷能力。因此，面對層出不窮的新冠病毒突變株，開發(fā)抵抗病毒逃逸的廣譜型中和試劑迫在眉睫。陳鵬/林堅團隊與中國科學(xué)院武漢病毒研究所王曼麗團隊合作，通過向抗體類“中和試劑”引入可進行“鄰近化學(xué)反應(yīng)”的非天然氨基酸，實現(xiàn)了其與活病毒表面靶標(biāo)蛋白的共價交聯(lián)反應(yīng)，并展現(xiàn)了這一“共價化學(xué)”策略在抵抗新冠病毒突變逃逸方面的潛力。共價蛋白中和試劑（GlueBinder）與新冠病毒刺突S蛋白通過在結(jié)合界面原位發(fā)生的鄰近化學(xué)反應(yīng)，將可逆的抗原-抗體結(jié)合轉(zhuǎn)化為不可逆的共價連接，實現(xiàn)了對野生型，Delta，Kappa以及Omicron等突變亞型RBD蛋白的交聯(lián)，最終恢復(fù)了蛋白中和試劑對Delta變體活病毒的中和能力(圖3)。體外競爭ELISA和活病毒中和實驗都證明GlueBinder對新冠病毒逃逸突變株具有更強的阻斷能力，這對恢復(fù)現(xiàn)有中和抗體的抗病毒作用具有借鑒意義。值得注意的是，共價改造策略針對全球大流行的Delta，Omicron等突變株都能夠保持高效交聯(lián)效果，體現(xiàn)了這一策略在抵抗病毒突變的通用性，為抗擊新冠病毒提供了新思路。

北京大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院博士生魏書程、楊紹軍、博士后曾祥梅；博士生劉宏宇、博士后羅惠新；博士生韓雨、楊振霖和中國科學(xué)院武漢病毒研究所博士生胡恒睿分別為上述論文的共同第一作者。該系列工作得到了國家自然科學(xué)基金委、科技部、北京分子科學(xué)國家研究中心、生物有機與分子工程教育部重點實驗室以及北大-清華生命科學(xué)聯(lián)合中心的資助。

原文鏈接：

https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacs.1c12924

https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacs.2c00159

https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacs.1c11554