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化學反應通常以單分子形式進行描述，卻極少在單分子水平上被監測和表征，目前對化學反應的分析大多是基于體系內總體平均的結果，然而，平均效應會掩蓋單分子行為造成一些重要信息的丟失。極少先進的單分子分析儀器可以報告單分子不同方面的特性，生物納米孔算是其中最具“性價比”的技術，它適合研究水相環境中的化學反應，提供較高的分辨率。然而，由于解析單分子化學的納米孔反應器構建十分困難，這種酷炫的技術遇到了技術瓶頸。因此，亟需一種技術突破，可以實現任何類型，數量或空間組合的反應位點，完全自由地放置在納米孔道內任何位置上，以此實現最大自由度地構建納米孔單分子反應器。

近日，南京大學化學化工學院黃碩教授課題組報道了一種可編程納米孔單分子反應器技術（Programmable Nano-Reactors for Stochastic Sensing, PNRSS, /p’na:s/），并借此方法快速構建了5種納米孔單分子反應器，報告了20個單分子化學反應。該技術巧妙地將功能化反應位點設計在DNA鏈上，DNA鏈在納米孔中電場力作用下充分拉伸，并利用親和素阻擋，防止穿過孔道，DNA鏈上暴露的反應位點，可以與自由轉移的分析物結合，匯報信號。這條DNA鏈被定義為PNRSS鏈，由功能模塊組成，在反應區域的反應位點可以進行任意功能化修飾，并且該位點與納米孔識別區域的相對位置可以通過延伸區域進行微調，以滿足不同的分析需求，實現最大限度可編程性。

天然的核酸堿基，如鳥嘌呤、腺嘌呤或它們的任何組合，可以作為配體與金屬離子結合。在PNRSS技術的第一個演示實驗中，以雙鳥嘌呤作為配體，協同結合Ni²⁺離子，匯報出信號（圖1）。通過對這一現象進行理論模擬，發現N(7)和O(6)原子在Ni²⁺配位中起關鍵作用。 

圖1.PNRSS技術的概念演示

除了天然堿基，更多人工合成的修飾堿基單體，為PNRSS鏈的設計和合成提供了極大的自由，徹底拓寬了PNRSS技術的應用。在后續的實驗中，PNRSS鏈上合成引入一個包含炔基的胸腺嘧啶衍生物，通過點擊反應修飾含有各種功能化基團的疊氮基衍生物，進一步闡述PNRSS技術。

去甲腎上腺素、腎上腺素和異丙腎上腺素是三種兒茶酚胺衍生物，在生命體內具有不同的功能。這些功能上的差異是由于它們化學結構的細微變化造成的。通過在PNRSS鏈上修飾苯硼酸基團，三種兒茶酚胺衍生物在PNRSS測量中匯報出豐富的化學反應信息，結合機器學習算法，實現混合樣品中傳感事件的自動識別，準確率高達98.0%（圖2）。 

圖2. PNRSS技術同時傳感和鑒定去甲腎上腺素，腎上腺素和異丙腎上腺素

瑞德西韋是一種抗病毒藥物，作用是阻斷RNA依賴的聚合酶，阻止病毒進一步復制，在細胞中代謝轉化為其活性的三磷酸形式。使用PNRSS技術，可以在限域空間中確定瑞德西韋及其代謝物與苯硼酸的單分子結合動力學，并實現了二者的直接鑒別。以上演示擴大了PNRSS技術可研究的反應物類型，可能會啟發藥物動力學或藥物篩選的應用（圖3）。 

圖3.PNRSS技術傳感核苷類似物抗病毒藥物瑞德西韋及其三磷酸代謝產物

此前報道的納米孔單分子化學的研究大多局限于可逆反應，因為任何發生在納米孔腔內反應位點的不可逆反應都將終止新的化學信息的產生。然而，在PNRSS技術中，含有反應位點的PNRSS鏈可以通過電壓與孔道分離或是重新加載，可以重復監測一個不可逆的單分子反應，這是PNRSS技術的獨特性（圖4）。

圖4. PNRSS技術對不可逆化學反應的反復測量

PNRSS技術的出現打破了納米孔單分子化學研究中構建納米反應器的技術瓶頸，可以將任何數量或類型的活性基團引入納米孔腔的任何點。有了PNRSS技術，原本針對納米孔進行的蛋白質工程改造，已經轉化為合成功能性的DNA，這是無數生物化學實驗室或公司提供的一項低成本服務，大大降低了納米孔單分子化學研究工作的門檻。

該工作以“Programmable nano-reactors for stochastic sensing”為題，于2021年10月4日發表于《Nature Communications》（文章鏈接：https://www.nature.com/articles/s41467-021-26054-9，DOI: 10.1038/s41467-021-26054-9）。我院博士生賈文東為該論文第一作者，我院黃碩教授為論文通訊作者，陳洪淵院士對該工作做出了重要指導。我院馬晶教授，博士生顧玉明在理論計算方面提供了大力幫助。此項研究得到了生命分析化學國家重點實驗室以及南京大學化學和生物醫藥創新研究院（ChemBIC）的重要支持。國家自然科學基金（項目編號：31972917，91753108，21675083）、江蘇省高層次創業創新人才引進計劃（個人、團體計劃）、江蘇省自然科學基金（項目編號：BK20200009）、南京大學卓越計劃（項目編號：ZYJH004）、上海市市級科技重大專項、南京大學生命科學分析化學國家重點實驗室（項目編號：5431ZZXM1902）、南京大學科技創新基金資助項目等經費支持。

參考資料：https://chem.nju.edu.cn/43/e7/c12639a541671/page.htm