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納米孔道是一種自然界廣泛存在的可運輸離子、水分子和生物分子的納米級孔道。生物納米孔道可由天然的蛋白質構成。近年來，研究人員利用電場力將單個分子牽引至單個生物納米孔道內，排開孔道內的部分離子，進而產生特征的離子流阻斷信號反應了單分子的化學組成、質量、結構等信息，這便是納米孔道單分子電化學的基本原理。納米孔道內壁氨基酸殘基、質子、離子及單個傳輸分子之間發生的協同弱相互作用還會引起限域空間內幾十個離子的瞬態變化，其產生的極微小的離子流信號常常被掩蓋在納米孔道的電流噪聲中，使得這些單分子特征信息無法獲取。

圖1. 納米孔道中的單分子特征離子指紋圖譜分析方法(A)納米孔道單分子電化學測量原理圖（左）；單個模型分子poly(dA)₄通過Aerolysin納米孔道產生的離子流特征信號（右上），及該信號被經驗模態分解(EEMD)后獲得的本征模態函數(IMF)；(B)經希爾伯特-黃瞬時頻率分析變換后的單分子特征離子頻率譜圖；(C)低頻域區下單分子特征離子頻率譜圖。

研究團隊將單個單個模型生物分子poly(dA)₄穿過Aerolysin蛋白質孔道所獲得的離子流電號經過經驗模態分解(EMD)及希爾伯特譜分析(HAS)，獲得了信號在整個測量頻率相應范圍內的單分子特征離子頻率譜圖，提取了特征峰值頻率(f_m)和峰值振幅(a_m)。通過研究不同pH、電解質濃度及類型、外加電壓、溫度等條件下的單分子特征頻率指紋圖譜變化，發現離子、單個傳輸分子、納米孔道內壁氨基酸殘基間的可逆平衡調節了質子、離子與納米孔道的結合/解離過程，影響了離子流電信號的低頻組分。進一步，研究團隊總結了特征頻率的物理化學特性，即f_m反映了納米孔道內離子與孔道內壁氨基酸殘基間的解離速率，a_m描述了納米孔道內壁氨基酸殘基在限域相互作用網絡下的結合離子數目。

圖2.特征峰值頻率(f_m)和峰值振幅(a_m)的影響因素研究(A) pH；(B)離子強度；(C)離子種類；(D)實驗溫度；(E) 施加電壓。揭示離子相互作用網絡的峰值頻率(上)和峰值振幅(下)。

圖3. 單分子特征離子指紋圖譜及預測研究(A)系列238位點突變型AeL納米孔道238（左）及特征峰值頻率(f_m)的相關性分析（右）；(B)特征峰值頻率(f_m)與突變氨基酸等電點，單分子阻斷時間，突變氨基酸范德華體積間的非線性依賴關系；(C) 238位點突變型AeL納米孔道的單分子特征離子指紋圖譜預測模型。

為進一步驗證單分子特征離子指紋圖譜的普適性，研究人員構建了系列238位點突變型Aerolysin納米孔道，改變了納米孔道靈敏探測區域內氨基酸殘基與單個生物分子的相互作用，歸納了氨基酸殘基的化學特性對頻率指紋特性的影響規律。化學加。實驗結果顯示，在無分析物存在于納米孔道的情況下，特征峰值頻率(f_m)與體系電導相關；而在有單個分子通過納米孔道的時候，特征峰值頻率(f_m)與突變位點氨基酸殘基化學性質的相關性顯著增加。進一步，利用多元回歸分析建立了單分子頻率指紋圖譜經驗模型，描述了離子指紋圖譜特征f_m和氨基酸殘基電性、范德華體積、親疏水性等物理化學特征間的關系，實現了對突變型納米孔道離子指紋圖譜頻率特征的預測。該方法有助于精準探測納米孔道單分子動態相互作用，實現納米孔道單分子蛋白質測序。

相關成果以“Single-Molecule Frequency Fingerprint for Ion Interaction Networks in a Confined Nanopore”為題(VIP Paper)，發表于《德國應用化學》(Angewandte Chemie International Edition)文章鏈接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/anie.202108226

該工作得到了國家自然科學重大科研儀器研制項目及優秀青年基金項目、南京大學化學和生物醫藥創新研究院的支持，南京大學化學專業博士研究生李欣怡為論文的第一作者，應佚倫教授和龍億濤教授為論文的通訊作者。

參考資料：https://chem.nju.edu.cn/3a/06/c12639a539142/page.htm