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膽汁酸受體TGR5（Takeda G protein-coupled receptor 5）在血糖穩態、能量消耗和肝臟保護等方面起重要作用，是一個極具潛力的治療代謝綜合征及炎癥性疾病的藥物靶點。然而，多種已報道的TGR5激動劑在人和小鼠體內存在較大的活性差異，利用現有的嚙齒類動物模型開展化合物藥效學和毒理學研究會產生偏差。近日，中國科學院上海藥物研究所研究團隊發現鼠源TGR5中的第88位組氨酸（人源TGR5中的第89位酪氨酸）是造成人鼠受體活性差異的關鍵，進而利用CRISPR-Cas9構建了TGR5^H88Y人源化小鼠模型，并利用該模型驗證了白樺脂酸類衍生物11d-Na是一個體內體外藥理藥效優異的TGR5激動劑。相關成果發表在J. Med. Chem.上。

　　膽汁酸是兩親性的類固醇，由肝臟合成后儲存于膽囊，膽汁酸除了參與食物來源脂質消化吸收以外，也作為體內的的信號分子，在血糖穩態，脂質調節，能量代謝等方面發揮重要的功能。膽汁酸在體內可激活核受體FXR（farnesoid X receptor）及膜受體TGR5（Takeda G protein-coupled receptor 5）。TGR5也被稱為G蛋白膽汁酸偶聯受體1（G protein-coupled bile acid receptor 1，GPBAR1），與G_αs相偶聯，廣泛表達于多種的細胞類型。TGR5的激活不僅可以直接刺激胰島β細胞分泌胰島素，也可作用于腸內分泌細胞，通過促進GLP-1（glucagon-like peptide 1）的分泌，以間接的方式作用于胰島素的分泌，因而成為備受關注糖尿病藥物的靶點。

　　然而，在TGR5激動劑的開發中，許多化合物在鼠源的TGR5受體（mTGR5）上的活性和在人源的TGR5（hTGR5）上相比有顯著差異，而在犬受體（cTGR5）上的活性則與人相當。研究團隊前期發現白樺脂酸類化合物在各種屬TGR5上的活性差異尤為明顯，這就意味著利用現有的嚙齒類動物模型開展化合物藥效學和毒理學研究會產生偏差。為了解決這一問題，研究人員從TGR5種屬差異入手，通過比對不同種屬的TGR5序列，重點關注了在人源和犬源受體上氨基酸相同，但在鼠源受體上不同的位點，并發現鼠源受體中的第88位的組氨酸是一個影響其活性的關鍵位點。研究人員將該位置上的組氨酸突變為人源/犬源受體中的酪氨酸之后，多類化合物尤其是白樺脂酸類衍生物在mTGR5^H88Y突變體上的活性顯著提升，與hTGR5上的活性差異大大減小。隨后研究人員利用CRISPR/Cas9技術在小鼠中引入了這一突變，構建了TGR5^H88Y人源化小鼠，這為后續藥效學研究提供了便利。

圖1 通過CRISPR-Cas9構建TGR5^H88Y人源化小鼠

　　同時，研究人員以白樺脂酸類TGR5激動劑XYT528B為起點，通過對C3位改造，得到了活性更優異代謝更穩定的氨基甲酸酯結構3d，并且用docking解釋了活性增強的原因，即氨基甲酸酯中的羰基O和NH分別與hTGR5中Tyr240和Ser247形成氫鍵相互作用；C17羧基為活性保持所必需，任何改變都會使活性出現明顯下降；而對于C20位的結構優化，得到的活性最好的化合物11d，其在hTGR5上活性較INT777提高近20倍。

　　考慮到三萜類化合物固有的理化性質缺陷，研究人員采取成鹽的方式得到溶解度和滲透性大幅提升的化合物11d-Na（hTGR5 EC₅₀ = 6.81 ± 1.8 nM）。在TGR5^H88Y人源化小鼠模型上進行的藥效學實驗中，11d-Na表現出良好的改善糖耐量的活性，也顯著提升了給予葡萄糖后突變鼠體內的胰島素和GLP-1的分泌水平（在野生型小鼠模型中難以觀察到11d-Na的降糖活性）。

圖2 化合物11d-Na在體外和體內TGR5^H88Y上表現出更好的活性

　　綜上所述，此研究闡明了小鼠TGR5中第88位組氨酸（人源TGR5中第89位酪氨酸）是造成TGR5活性種屬差異的關鍵位點，通過CRISPR/Cas9將mTGR5相應的第88位組氨酸被替換為酪氨酸，成功構建了TGR5^H88Y人源化小鼠。通過此人源化模型，研究者成功發現了體內體外活性及理化性質顯著提升的白樺脂酸衍生物11d-Na，為進一步獲得高質量高成藥性TGR5激動劑奠定了基礎。

　　上海藥物所博士生贠盈、上海藥物所博士后張晨露以及南京中醫藥大學與上海藥物所聯合培養博士生郭世猛為該論文共同第一作者。南發俊研究員和謝欣研究員為共同通訊作者。該工作獲得包括國家自然科學基金委、上海市科委、中科院先導專項以及山東省自然科學基金的支持。

　　原文鏈接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.jmedchem.1c00851

參考資料：http://www.simm.ac.cn/web/xwzx/kydt/202108/t20210824_6167398.html