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李家洋，博士，植物分子遺傳學家，中國科學院院士、發展中國家科學院院士、美國國家科學院外籍院士、德國科學院院士，中國科學院遺傳與發育生物學研究所研究員、博士生導師 。

葉綠體和線粒體是細胞進行氧化還原反應的兩個重要細胞器，這些氧化還原反應支撐著細胞的能量代謝，當氧氣被部分還原時，便會生成ROS（活性氧）。ROS信號傳遞使細胞對其產生響應，從而使細胞調節自身以適應氧化還原態的變化。之前有研究認為蘋果酸閥(malate valve)能夠釋放葉綠體中過量的還原當量，但缺少NADP-依賴的蘋果酸脫氫酶這一關鍵酶的突變體卻并未出現葉綠體功能受損，暗示替代途徑的存在。近期的擬南芥研究揭示了葉綠體可利用NAD-依賴的蘋果酸脫氫酶運出還原力，即葉綠體NADH可被用于生成蘋果酸，隨后蘋果酸被轉運至線粒體，經氧化后重新生成NADH，線粒體NADH可為線粒體電子傳遞鏈提供電子，在電子傳遞過程中發生電子滲漏，導致產生線粒體ROS (mROS)，mROS能夠激活信號轉導途徑從而調節能量代謝，在某些情況下則能夠引發程序性細胞死亡(PCD)。

近日，李家洋院士攜中國科學院遺傳與發育生物學研究所、中國科學院大學及澳大利亞塔斯馬尼亞大學研究人員在Cell Press細胞出版社旗下期刊Trends in Plant Science上發表觀點綜述文章(Opinion)，該文章認為從葉綠體到線粒體的(chloroplast to mitochondrion, CTM)蘋果酸轉運系統與葉綠體氧化還原應激相關，并提議以“蘋果酸循環(malate circulation)”來描述此種還原當量(reducing equivalents)的再分配對細胞內能量穩態的調節，并從九個方面對其進行了系統闡述。

1. 調控葉綠體還原力所面臨的挑戰

由于光合作用的電子傳遞反應將產生整個細胞中同化及生物合成所需的所有還原當量，葉綠體被認為是ROS的主要生成細胞器。而ROS的生成會觸發氧化信號轉導，引發細胞功能變化，因此，維持還原力產生及消耗間的平衡至關重要。

蘋果酸閥被認為是在葉綠體消除還原當量中發揮作用的方式之一。這種觀點認為過量NADPH可被質體NADP-依賴的蘋果酸脫氫酶(plNADP-MDH)消耗，產生蘋果酸，蘋果酸可被轉運出葉綠體進行進一步氧化反應。但plNADP-MDH的缺失突變體，在光合脅迫條件下卻未受到影響，暗示存在其他機制。新的研究發現，過量的葉綠體NADH可被質體定位的NAD-依賴的蘋果酸脫氫酶(plNAD-MDH)消耗，而反應產生的蘋果酸被轉運至線粒體，線粒體蘋果酸被氧化，產生NADH，隨后NADH又被線粒體電子傳遞鏈復合體I氧化，極端情況下，NADH提供的電子在沿電子傳遞鏈傳遞過程中產生的ROS將觸發細胞死亡。

2. 線粒體中的ROS

當細胞中還原當量供應大于需求時，光合電子傳遞鏈(pETC)中的電子載體被過還原，葉綠體即產生ROS。線粒體可通過將電子從還原劑傳遞至氧分子來緩解細胞中的過度還原。然而，線粒體中氧的部分還原可導致mROS的產生，但這一過程的控制機制尚不清楚。mROS的生成對于植物應對多種非生物脅迫來說至關重要，例如因氣候變化而加劇的高溫及干旱。

線粒體mROS的生成與線粒體電子傳遞鏈(mETC)緊密相關，其產生速率隨著呼吸速率降低而升高。在光合組織中，光照下線粒體產生的ROS相對較少，這是由于植物線粒體存在交替氧化酶(AOX)，AOX可使電子從泛醌直接傳遞至氧，從而減少ROS生成。mROS還與PCD誘導相關，即在脅迫環境中及PCD過程中，mETC被抑制時細胞生成mROS。然而，有研究揭示AOX過表達可阻止PCD的發生。還原當量驅動mROS生成以響應脅迫環境的機制尚不明確，但蘋果酸可能在其中發揮作用。

3. 葉綠體在mROS生成及細胞死亡中的潛在新功能

蘋果酸在mROS生成中的重要作用的發現來源于研究人員對擬南芥葉綠體功能缺陷突變體mosaic death1 (mod1)研究的意外收獲。mod1的異常生長表型與馬賽克型細胞死亡(mosaic cell death)密切相關。MOD1編碼葉綠體中的烯酰-ACP還原酶(ENR)，該酶是脂肪酸合酶(FAS)復合體的一個亞基。擬南芥中ENR由單基因編碼，該基因在突變體mod1中發生了單堿基突變，導致一個氨基酸替換，使得突變體中ENR酶活顯著下降。

研究人員從mod1背景的T-DNA插入突變體庫中篩選出一系列mod1抑制突變體株系suppressor of mod1 (som)。對其中som3進行分析，發現SOM3基因編碼線粒體復合體I的一個亞基；som42為SOM42過表達突變體，SOM42編碼一個定位在線粒體的PPR (pentatricopeptide repeat)蛋白，該蛋白可負調控編碼復合體I亞基的NAD7的轉錄本含量。同時，復合體I活性降低的突變體也可抑制mod1表型及mROS的生成，而在mod1中過表達AOX1a可抑制mROS水平及細胞死亡。由此可推測出，葉綠體與線粒體之間可能存在一種直接的交流路徑。

4. 葉綠體NADH-依賴的蘋果酸循環在mROS生成中的作用

為理解mod1中葉綠體與線粒體是如何進行交流的，研究人員篩選出了一系列線粒體復合體I活性未降低的som突變體，并鑒定到四個mod1抑制基因。其中任一基因的突變均可抑制mROS積累和mod1細胞死亡表型。四個基因中有三個基因編碼的是葉綠體與線粒體之間蘋果酸穿梭途徑的關鍵組分，分別為質體NAD-依賴的蘋果酸脫氫酶(plNAD-MDH)、葉綠體二羧酸轉移酶1 (DiT1)及線粒體NAD-依賴的蘋果酸脫氫酶(mNAD-MDH1)。進一步的深入研究表明，在mod1中，葉綠體中累積的NADH被plNAD-MDH氧化后，所產生的蘋果酸通過DiT1與細胞質基質中的草酰乙酸(OAA)進行反向運輸，蘋果酸被轉運出葉綠體，再被轉運至線粒體，隨后線粒體內蘋果酸再被mNAD-MDH1氧化，產生NADH，NADH為線粒體電子傳遞鏈提供電子，在電子傳遞過程中產生mROS。在這種"蘋果酸循環"中，還原當量以蘋果酸的形式從葉綠體轉移至線粒體。此外，研究人員還鑒定到可抑制mod1表型的新突變體，即線粒體NAD+轉移酶2(NDT2)功能缺失突變，該突變可抑制mod1中mROS生成及PCD的發生，表明mod1中線粒體需要額外大量的NAD+才能保證線粒體中蘋果酸被充分氧化，產生mROS和PCD。

此前認為葉綠體蘋果酸閥在光合作用過程中利用plNADP-MDH消除過量的NADPH。與plNADP-MDH相比，plNAD-MDH在所有質體中均存在，對"敲除"plNADP-MDH的擬南芥的研究顯示，葉綠體在氧化還原應激響應中還存在其他機制，而目前對 mod1的分析表明，plNAD-MDH在應對光照條件下葉綠體NADH積累的響應中發揮著重要的作用。

5. plNAD-MDH的多重角色

擬南芥plNAD-MDH的缺失突變體是早期胚胎致死的，這一度讓人們認為plNAD-MDH的酶活功能在擬南芥早期胚胎發生中發揮著重要的代謝功能。近來有研究發現，plNAD-MDH表達量降低的植株呈現出生長不良、葉片蒼白、葉綠體組織異常及呼吸作用降低的現象，表明plNAD-MDH在植物發育的多個階段均發揮重要作用，并且缺失該酶的葉片中葉綠體發育也是受損的。但當研究人員向plnad-mdh突變體的質體中轉入其他細胞器來源的NAD-MDH酶時卻發現，這些NAD-MDH的酶活性并不能回補plNAD-MDH的缺失表型，而喪失酶活性的點突變plNAD-MDH卻能夠回補plNAD-MDH的缺失表型。這一結果說明， plNAD-MDH蛋白質本身而非其酶活性，才是質體發育所必需的。

研究人員通過進一步研究發現，plNAD-MDH與另一蛋白FtsH12可形成一種復合體，FtsH12是葉綠體內膜相關的FtsH12-FtsHi復合體的亞基，可能參與質體的蛋白質內運。此外，plNAD-MDH蛋白還與淀粉代謝相關酶互作，暗示其在質體功能方面可能還具有其他作用，即plNAD-MDH在質體生物發生及CTM蘋果酸通路上均有重要意義。 

6. 葉綠體NADH代謝

突變體mod1與som的研究表明，光照條件下葉綠體中NADH的代謝是十分重要的。在生長的葉片中，脂肪酸合酶對NADH的消耗是相當可觀的，因此，葉綠體中NADH的來源也值得重視。質體丙酮酸脫氫酶復合體(PDC)分解丙酮酸，產生NADH及乙酰輔酶A，NADH和乙酰輔酶A又在脂肪酸合成過程中分別被ENR和乙酰輔酶A羧化酶所消耗。

葉綠體中NADH的另一可能來源是卡爾文循環所產生的磷酸丙糖通過NAD+依賴的3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPCp)產生NADH。然而，GAPCp1及GAPCp2在根部的表達量均高于葉片，而且葉綠體中缺少糖酵解途徑中的關鍵酶，因此葉綠體中是否存在完整的糖酵解途徑備受懷疑。目前人們普遍認為，細胞質基質中的磷酸烯醇丙酮酸被轉運至葉綠體中，并被轉化為丙酮酸，丙酮酸分解產生的NADH及乙酰輔酶A用于脂肪酸合成。若葉綠體中GAPCp為激活狀態，將會產生過量NADH，此時plNAD-MDH便能夠氧化過量NADH，使蘋果酸從質體中轉運出來。

7. 從葉綠體到線粒體的蘋果酸穿梭

通過plNAD-MDH生成的葉綠體蘋果酸會有怎樣的命運呢？它可以被DiT1由葉綠體轉運至細胞質基質中，一旦進入細胞質基質，蘋果酸就有了很多潛在的去向。然而，在mod1中，從葉綠體運出的蘋果酸顯然進入了線粒體中，成為了線粒體mNAD-MDH1的底物。

這便引發了對細胞質基質蘋果酸其他可能去向的疑問。除plNAD-MDH以外，擬南芥基因組還編碼另外7種NAD-依賴的MDH，其中2種位于線粒體，2種位于過氧化物酶體，3種位于細胞質基質中。來自葉綠體的蘋果酸有可能被轉運至過氧化物酶體，被pMDH氧化生成NADH，以支持光呼吸中的羥基丙酮酸還原酶反應。光呼吸是光下植物葉片的核心反應之一，它需要利用細胞質基質中的MDH和NADH將OAA還原回蘋果酸。因此，在光照條件下，細胞質基質傾向于將OAA還原為蘋果酸。

8. 葉綠體至線粒體的蘋果酸循環與植物生長

正常條件下plNAD-MDH缺失突變體som410地上部生物量少于野生型，而連續光照條件下突變體地上部生長情況好于野生型，并且突變體的mROS水平更低。說明在可以導致葉綠體內還原力積累的條件下，還原當量可以通過蘋果酸循環排出葉綠體，并導致mROS產生。還說明CTM蘋果酸途徑能夠調節植物地上部分生長。

可以推測plNADP-MDH和plNAD-MDH在葉綠體中同時運作以生成蘋果酸。mod1中，脂肪酸生物合成被阻斷，導致NADH水平升高，促使plNAD-MDH生成蘋果酸。但葉綠體存在其他方法調節NADPH水平，因此NADPH可能并不如NADH重要。

9. mROS生成與逆行信號

如前所述，細胞質基質NAD-MDH穩態傾向于OAA向蘋果酸的還原反應，葉綠體中蘋果酸與細胞質基質OAA的交換導致細胞質基質中蘋果酸含量上升，促使蘋果酸進入線粒體。我們猜想蘋果酸可能是一種細胞感知葉綠體的氧化還原狀態的"指示器"。

另一個需要考慮的問題是，既然線粒體存在將mROS生成最小化的諸多途徑（如通過AOX），為什么蘋果酸氧化還是可以導致mROS生成。AOX的轉錄水平可被多種脅迫誘導，AOX過表達則可以通過維持電子在mETC中的流動來抑制mROS生成，從而增強了植株的脅迫耐性。然而，令人驚訝的是，mod1中被誘導高表達的是AOX1d而非AOX中的主要異構體AOX1a。但實驗表明AOX1a的過表達也可減輕mod1中的mROS積累并阻止PCD。

其他的未解之謎主要圍繞mROS作為信號分子，是如何向細胞核提供信息，并調控生長和脅迫響應。另一個令人激動的可能性是，上述線粒體響應可能還包括葉綠體蛋白輸入機制調節，而plNAD-MDH可能直接參與其中。

總結

先前在對CTM交流系統進行研究時，曾假設存在一種信號分子，該分子可能是脂肪酸代謝產物，能夠在細胞器間穿梭，并引發mROS生成。如今，遺傳學及分子生物學證據顯示，正是蘋果酸，作為葉綠體中氧化還原平衡的調節物，通過蘋果酸循環的方式從葉綠體轉運至線粒體，與運至線粒體的NAD+共同作用，導致mROS的產生。mROS則可能影響植物生長，在極端條件下引發PCD。未來應注重研究蘋果酸循環在不同生長條件下的作用，以及可由mROS觸發的響應，這將為突破植物在不同環境脅迫下的生長瓶頸提供新的思路。

作者專訪

近期，Cell Press對李家洋院士進行了專訪，就如何選擇自己的科研課題，植物研究面臨的挑戰，青年學者如何做研究等方面李家洋院士給出了自己的建議和觀點。先將專訪內容全文轉載，和大家分享。

Cell Press：

您是如何選擇自己的科研課題的？

李家洋院士：

我覺得選擇自己的科研課題，要從三個方面考慮，首先是原創性，研究的課題是引領性的前沿問題，要解決科研上的難點；其次是能否與國家的重大需求相結合，這樣做出來的成果不但具有重要的科學意義，而且能產生重大的社會效益；第三是課題有沒有堅實的研究基礎，創新的想法不是憑空想象，一定是在符合科學規律的前提下創新，課題要具有科學上的可實現性。因此，這20多年來，我們實驗室的研究工作主要就圍繞如何提高我國主要糧食作物水稻的產量和品質來進行，發現株型改良是產量提高的核心，而淀粉合成途徑是影響稻米品質的關鍵，在國內率先建立了水稻圖位克隆技術體系，鑒定了控制水稻株型和稻米品質的關鍵基因和遺傳調控網絡，并通過與育種家合作進一步應用到水稻育種實踐中，培育出一系列高產優質水稻新品種

Cell Press：

對于植物學研究來說，您認為未來我們面臨的最大挑戰將是什么？您自己的長期研究目標是什么？

李家洋院士：

在植物學研究領域我們面臨的最大挑戰可能是能量的綜合利用效益問題。植物通過光合作用固定太陽能，提高植物的光能利用效率是提高單位面積作物產量的重要方面。我長期研究的目標，還是要保障我國的糧食安全，闡明植物生長發育和環境適應的分子機制，培育產量高、品質好、抗病抗倒耐逆的優良水稻新品種，為我國水稻的高產、優質、穩產提供保障。

Cell Press：

您希望公眾對于科學的哪些方面有更多的了解?

李家洋院士：

科學研究要求實創新，服務社會。求實即不違反客觀規律，實事求是；創新即推陳出新，破舊立新；服務社會即面向國家重大戰略需求，提高自主創新能力，解決生產生活中的實際問題。希望公眾多了解科研創新背后的故事，理解科學的內涵和精髓，尊重科學，尊重知識，關注如何推動科學研究向更廣、更深、更精的方向發展。

Cell Press：

您有何建議可以與廣大青年學者分享？

李家洋院士：

青年人是科學研究的中堅力量，我們實驗室所有的科研成果都浸透了青年學者包括研究生們的智慧、心血與汗水，他們大有可為，前途光明。我有以下三點建議：

首先，做科研要有一個遠大的理想與目標。這個目標要高于找工作、謀飯碗，也要高于對社會身份和地位的追求。事實上，每個人在潛意識里都有對理想的追求，都想做些別人做不到的事，你的目標應該是這樣的理想追求。

其次，要有勇于創新的信心和鍥而不舍的精神。做生命科學研究，很累很辛苦，只有對自己的研究工作抱有信心，對新成果新發現充滿期待，才不會覺得辛苦疲憊。研究過程中一定會遇到很多困難、挫折和失敗。如果你沒有堅強的意志，很容易半途而廢。

最后，要有合作共贏的團隊精神。在生命科學研究中任何一個重要的發現與成果的取得都是一個群體的智慧結晶，希望廣大青年學者能夠精誠合作，與同行共享實驗材料、方法和技術，能深入探討想法，交流經驗。

參考資料

[1]  微信公眾號“CellPress細胞科學”（ID：CellPressChina），李家洋院士團隊：蘋果酸循環——葉綠體代謝與線粒體ROS間的“調節器”