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第二個近紅外窗口（NIR-II，1000-1700 nm）中的熒光團由于比第一個近紅外窗口（NIR-I，650-900 nm）具有更好的成像質量和更深的組織穿透力而受到廣泛關注。目前，NIR-II熒光團主要以無機納米材料為基礎，但其有爭議的毒性阻礙了其臨床前的轉化。相比之下，有機小分子染料，如亞甲基藍和吲哚青綠（ICG），已呈現出令人滿意的安全性，并已在臨床上使用多年。因此，有機熒光團是體內成像的首選。到目前為止，NIR-II型有機小分子熒光團主要有兩種類型。一種是聚甲基，但其斯托克斯位移有限，化學穩定性差。另一類熒光團具有給體-受體-給體（D-A-D）特性，一個典型的例子是苯并[1,2-c:4,5-c′]雙( [1,2,5]噻二唑)（BBTD）衍生物。與聚甲基硅氧烷相比，D-A-D熒光團在體內表現出更大的斯托克斯位移（>200 nm）和更高的信號背景比成像。但是現有的基于BBTD的熒光團在體成像的最大吸收波長和發射波長分別在800和1000 nm左右，仍然比較短。因此，開發具有更長波長的新型熒光團是非常需要的，這實際上是光譜探針領域最重要的前沿課題之一。

為此，作者研究了目前構建基于BBTD的NIR-II熒光團的方法，發現在BBTD骨架中用硒取代硫原子可以增加分析波長；另一方面，引入給電子氨基也可以延長波長。然而，這些措施只會導致波長紅移≤50 nm，如何進一步增加波長仍然是一個挑戰。在本研究中，作者同時在BBTD骨架中引入一個硒原子和一個氨基，設想這樣的結合會導致波長的大幅增加。通過這種設計，作者研制了一種新型的有機小分子熒光團FM1210，其最大發射波長為1210 nm，并與硫取代類似物CF1065的光譜特性和圖像質量進行了比較。值得注意的是，FM1210在發射波長上顯示出145 nm的大紅移，量子產率和亮度相當；這個波長增益大約是BBTD衍生物單次修飾所獲得的（～50 nm）的3倍。超過1200 nm的波長大幅增加可歸因于硒原子和氨基的協同作用，從而使使用FM1210的活體成像質量比CF1065高得多。這些優點進一步使NIR-II熒光成像能夠以100 fps的速度對整個小鼠身體進行。此外，作者還證明了納米級的FM1210脂質體（FM1210-NPs）可以應用于腫瘤及其血管系統的高信號背景比的活體成像。

圖1.近紅外熒光團FM1210和CF1065的結構（圖片來源：J. Am. Chem. Soc.）

比較了FM1210與CF1065的吸收光譜和熒光光譜。FM1210在CH₂Cl₂中在980 nm處顯示一個強吸收峰，在1210 nm處顯示一個熒光峰（量子產率0.036%）。相比之下，CF1065的吸收峰和熒光峰分別出現在855 nm和1065 nm處，量子產率為0.041%。FM1210的大紅移可能是由于重原子和引入的氨基在調節能隙方面的協同作用。為了深入了解結構與波長之間的關系，作者研究了四種不同結構的類似物的光譜性質，發現FM1210中硒原子和氨基同時存在有利于大波長紅移。這與對能隙的理論計算是一致的。

圖2. FM1210和CF1065在不同溶劑中的吸收光譜以及FM1210和CF1065在980和808 nm激發下的熒光光譜（圖片來源：J. Am. Chem. Soc.）

另一方面，FM1210和CF1065在磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）中表現出微弱的熒光（量子產率<0.01%）。然而，將這些染料添加到含有白蛋白的胎牛血清（fbs）或pbs中會產生顯著的熒光，這可能是由于染料-蛋白質復合物的形成。此外，fm1210和cf1065在fbs中是穩定的。以上結果表明染料可能有利于血管成像。還發現，fbs和白蛋白可引起cf1065和fm1210的最大發射波長發生藍移。< span="">

FM1210優越的光譜特性，低細胞毒性和無明顯器官損傷，啟發作者探索其在活體熒光成像中的應用。首先，對同一只BALB/c裸鼠在808 nm和980 nm激發下的自身熒光進行了測定。在相同的激發功率和曝光時間（ET）下，980 nm下的自熒光明顯弱于808 nm下的自熒光，說明較長的波長可以有效地降低自熒光。

靜脈注射FM1210或CF1065后，可觀察到明顯的血管熒光。仔細檢查發現，FM1210的血管顯示出比CF1065更高的分辨率；放大后的腹部血管圖像更清晰。放大后的股骨血管圖像也顯示出FM1210的對比度有所改善。此外，從股骨血管橫截面線的熒光強度分析顯示有四條血管存在。結果表明，FM1210可顯著提高活體成像的信號背景比。進一步研究了FM1210在小鼠血液循環和尿液排泄中的熒光動力學。FM1210在血液循環和尿液排泄中的半衰期分別為4.6±0.2 h和1.6±0.2 h。

圖3.攜帶FM1210和CF1065的BALB/c裸鼠的代表性NIR-II熒光圖像（圖片來源：J. Am. Chem. Soc.）

由于體內穿透深度有限，用NIR-I染料很難獲得高質量的視頻。在這里，作者使用FM1210，對一只麻醉老鼠的全身進行高速成像。即使分辨率為640×512像素，作者也可以以100 fps的速度獲得清晰的NIR-II視頻，這可能是NIR-II成像速率最高的。通過這段視頻，作者測量到每分鐘234次心跳。值得注意的是，心房搏動和心室搏動之間約0.12秒的細微延遲可以通過高速成像得到解決。作者還用同樣的方法對處于非麻醉狀態的老鼠進行了成像，并測量到每分鐘大約420次的心率。因此，FM1210可能為心臟研究提供一種有前途的方法。

圖4.高速成像麻醉小鼠靜脈注射FM1210（圖片來源：J. Am. Chem. Soc.）

腫瘤成像迫切需要具有被動靶向能力、良好水溶性和生物相容性的熒光納米粒子。因此進一步將FM1210包封于脂質體中，得到納米級的FM1210（FM1210-NPs），其含量為2.6±1.2%（w/w），粒徑為20-22 nm。在PBS中，FM1210-NPs比FM1210具有更強的熒光。重要的是，FM1210納米顆粒顯示出至少24小時的高穩定性、低細胞毒性和更好的水溶性。FM1210-NPs在血液循環和尿液排泄中的半衰期分別為5.7±0.4 h和2.3±0.3 h，表明其體內滯留時間比FM1210長。荷瘤小鼠尾靜脈注射FM1210-NPs后，腫瘤血管結構豐富而精細，其中擴張的血管和毛細血管易于區分。腫瘤內的熒光強度隨著時間的推移先增加后降低，這是由于FM1210-NPs在體內的動態變化所致。且FM1210-NPs在腫瘤內有蓄積的趨勢，腫瘤與正常組織的熒光比值最高出現在4 h，另外，24 h后，體外生物分布證實FM1210-NPS在腫瘤區域有效富集，這可能是被動靶向所致納米顆粒的能力。另一方面，用FM1210進行了等效研究，發現熒光信號并不集中在腫瘤區域。這些觀察結果表明納米級的FM1210納米顆粒可能對腫瘤研究有用。

圖5.FM1210-NPs的腫瘤熒光成像（圖片來源：J. Am. Chem. Soc.）

總結：總之，目前用于體內成像的小分子熒光團在1100 nm處熒光發射最大，而中國科學院化學研究所馬會民、史文課題組的新FM1210在1210 nm處熒光發射最大。與CF1065相比，FM1210的波長增加了145 nm更是一個很大的進步，這主要是由于硒原子和氨基的結合。且FM1210比CF1065顯示更低的背景，更好的分辨率和更高的信號背景比。使用FM1210，作者已經實現了100幀每秒的高速NIR-II成像。此外，FM1210-NPs還能成像腫瘤甚至其血管系統。總的來說，在體內成像中，FM1210比之前的小分子染料表現出了優勢。

撰稿人：馮虹