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先前的實(shí)驗(yàn)研究表明，一些羅丹明的非輻射衰變與TICT態(tài)的形成密切相關(guān)。因此，抑制可能的TICT形成是開發(fā)新的羅丹明衍生物的重要策略之一。在TICT狀態(tài)下，供體部分相對(duì)于熒光團(tuán)核發(fā)生一個(gè)約90°的旋轉(zhuǎn)，變得無輻射和高度反應(yīng)。為了抑制TICT，過去常常通過形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)使二烷基氨基供體分子剛性化。不幸的是，這種方法常常導(dǎo)致大分子結(jié)構(gòu)生物相容性差。大連理工大學(xué)肖義、楊偉課題組和新加坡科技設(shè)計(jì)大學(xué)劉曉剛課題組用一個(gè)簡單的季銨哌嗪基取代四甲基羅丹明(TMR)中的二甲氨基。由此產(chǎn)生的N,N-二甲基哌嗪取代的羅丹明(MPR)使TMR的亮度加倍，并保持了良好的生物相容性。

染料中TICT的形成本質(zhì)上受兩個(gè)因素控制:空間位阻和電子推拉效應(yīng)。他們認(rèn)為降低氨基的供電子強(qiáng)度會(huì)破壞TICT狀態(tài)的穩(wěn)定，從而加強(qiáng)進(jìn)入TICT狀態(tài)的能量屏障，可以抑制TICT的形成。因此注意到一個(gè)具有吸電性的季銨哌嗪基，帶正電荷的銨具有誘導(dǎo)作用，降低了鄰近氨基的供電子能力。那么用季銨哌嗪基取代二甲氨基應(yīng)該能最大限度地減少TICT的形成。

之后通過計(jì)算一系列氨基分子的垂直電離能(VIEs)來支持了上述推論。TMR和MPR在水中勢(shì)能的結(jié)果表明，TICT的形成面相對(duì)于TMR (0.42 eV)具有更大的能量屏障蛋白(0.50 eV)。此外，在MPR (0.15 eV)中，驅(qū)動(dòng)能量從局域激發(fā)態(tài)(LE)進(jìn)入TICT狀態(tài)遠(yuǎn)小于TMR (0.60 eV)。因此，MPR形成TICT的可能性應(yīng)小于TMR形成TICT的可能性。這些理論計(jì)算支持作者通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了季銨哌嗪在提高羅丹明亮度方面的策略。因此通過之前報(bào)道的哌嗪羅丹明的有效N-烷基化反應(yīng)合成了MPR。光譜研究表明,MPR在水溶液中相比 TMR(Φ= 0.47;ε= 7.8×10⁴ M^?1cm^?1)顯示出量子產(chǎn)率(Φ= 0.93) 顯著提高和摩爾消光系數(shù)(ε= 8.7×10⁴ M^?1 cm^?1) 顯著增加。

圖1. (a)導(dǎo)致發(fā)射態(tài)和非發(fā)射態(tài)的勢(shì)能剖面示意圖。(b)真空中各氨基的垂直電離能。(c) TMR和MPR在水中的勢(shì)能面。(d)季銨哌嗪熒光團(tuán)及其二甲胺類似物的光譜特性。（圖片來源： J. Am. Chem. Soc.）

之后作者進(jìn)一步比較了單分子水平上MPR和TMR的熒光。通過羧基位置相同，MPR和TMR均與免疫球蛋白G (IgG)偶聯(lián)，并吸附在表面上，因此可以研究它們?cè)谒?/span>溶液條件下的單分子特性。兩種化合物的單分子分布很稀疏，避免了重疊。與TMR-IgG相比，MPR-IgG的單分子亮度(518±63)、總收集光子數(shù)(4.06±0.26)×10⁴)、信噪比(信噪比:8.51±0.32)、定位精度(10.08±0.19 nm)均有顯著提高。這些結(jié)果與系綜光譜研究和量子化學(xué)預(yù)測(cè)相吻合。此外，在PBS和圖像增強(qiáng)緩沖液中，在一系列條件下證實(shí)了MPR-IgG的增強(qiáng)光子效果。仿真研究表明，與TMR-IgG相比，MPR-IgG顯示了改進(jìn)的基于局部化的超分辨率成像潛力。這些結(jié)果表明，季銨哌嗪策略有效地提高了羅丹明的亮度。

為了研究季銨哌嗪在超分辨率成像中的應(yīng)用，作者在HeLa細(xì)胞中加入了免疫染色的微管。重建后的圖像出現(xiàn)了微管的扭曲和交叉，與傳統(tǒng)圖像相比，表現(xiàn)出了相當(dāng)大的清晰度增強(qiáng)。對(duì)成像結(jié)果的比較表明，MPR的超分辨率成像能力優(yōu)于TMR。

圖2. 將MPR和TMR的羧基衍生物偶聯(lián)到IgG分子上后的單分子熒光信號(hào)、熒光軌跡及分子特性。MPR-IgG和TMR-IgG單分子亮度在PBS (pH = 7.4)溶液中隨激光功率的變化。（圖片來源： J. Am. Chem. Soc.）

為了進(jìn)一步探討MPR在活細(xì)胞中的適用性,作者設(shè)計(jì)了一個(gè)雙探測(cè)器——Mem-R(Φ= 0.64)來特殊性標(biāo)記質(zhì)膜，然后使用Mem-R對(duì)細(xì)胞膜進(jìn)行超分辨率成像。重建后的圖像顯示了細(xì)胞膜的詳細(xì)結(jié)構(gòu)，與傳統(tǒng)模糊圖像形成鮮明對(duì)比。進(jìn)一步分析重建后，估計(jì)平均單分子亮度為984，平均定位精度為20.9 nm。作者注意到，Mem-R的單分子亮度可以與DiI(一種基于Cy3的商用膜跟蹤器)相當(dāng)，這應(yīng)該歸因于Mem-R的量子產(chǎn)量比DiI高得多。此外由于Mem-R優(yōu)異的光物理特性，使得高密度單分子跟蹤實(shí)驗(yàn)成為可能，也揭示了Mem-R在質(zhì)膜上的非均勻擴(kuò)散。這些結(jié)果表明，Mem-R可以對(duì)細(xì)胞膜進(jìn)行高質(zhì)量的超分辨率成像。

圖3. Mem-R的分子結(jié)構(gòu)以及Mem-R染色的活HeLa細(xì)胞質(zhì)膜超分辨率圖像。Mem-R在(b)中標(biāo)記區(qū)域的高密度分子跟蹤，根據(jù)擴(kuò)散系數(shù)對(duì)軌跡進(jìn)行著色（圖片來源： J. Am. Chem. Soc.）

探針Lyso-R具有溶酶體靶向性且大部分是非質(zhì)子化的，在中性pH下熒光強(qiáng)度較低，其質(zhì)子化(pk1/2 =6.56)的結(jié)果是形成了一個(gè)高熒光的Lyso-RH，實(shí)現(xiàn)了季銨哌嗪策略。為了證實(shí)Lyso-RH的靶向性，使用溶酶體標(biāo)記蛋白(Lamp-1)對(duì)活的HeLa細(xì)胞進(jìn)行衍射受限共聚焦分析。在正常培養(yǎng)基下，活細(xì)胞溶酶體中反復(fù)出現(xiàn)暫時(shí)性分離信號(hào)。統(tǒng)計(jì)分析表明，Lyso-RH光開關(guān)的亮度超過了商用的Lysotracker Red探針。重建的圖像顯示了球狀溶酶體的真實(shí)形狀和大小，與衍射受限的圖像相比，其清晰度顯著提高。在超分辨率圖像中，溶酶體的寬度測(cè)量為70.3 nm，與電子顯微鏡報(bào)道的值相匹配。重建量化分析顯示與之前報(bào)告的結(jié)果相比較，空間分辨率高。此外，由于溶酶體中Lyso-RH在沒有過量圖像增強(qiáng)劑的情況下也具有持久的光敏作用，實(shí)現(xiàn)了長期的超分辨像，顯示了溶酶體在高空間分辨率下的異質(zhì)運(yùn)動(dòng)。

圖4. Lyso-R的質(zhì)子化在酸性溶酶體中原位生成Lyso-RH。以及 Lyso-RH染色的HeLa細(xì)胞溶酶體的超分辨率和常規(guī)圖像，彩色超分辨率圖像。（圖片來源： J. Am. Chem. Soc.）

最后，作者探討了季銨哌嗪策略的推廣性。量子化學(xué)計(jì)算預(yù)測(cè)，這種策略可以運(yùn)用到其它熒光團(tuán)上，如萘酰亞胺和NBD染料，隨后的實(shí)驗(yàn)表明亮度提高了77倍。

總結(jié)：綜上所述，大連理工大學(xué)肖義、楊偉團(tuán)隊(duì)和新加坡科技設(shè)計(jì)大學(xué)劉曉剛團(tuán)隊(duì)提出并證明了一種新的提高羅丹明染料亮度的策略，即以季銨鹽哌嗪為供體片段，降低推拉效應(yīng)，抑制扭曲的分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移。新設(shè)計(jì)的MPR與傳統(tǒng)的TMR相比，亮度提高了1倍。在MPR的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步開發(fā)了細(xì)胞膜探針Mem-R和溶酶體探針Lyso-RH。其優(yōu)異的熒光特性使其在單分子跟蹤和超分辨率成像實(shí)驗(yàn)中獲得了成功的應(yīng)用。這種季銨鹽化策略將會(huì)激發(fā)許多高性能熒光團(tuán)和探針的發(fā)展，并極大地促進(jìn)熒光成像技術(shù)的發(fā)展。

撰稿人：馮虹